植物细胞工程制药.ppt

3.种质转化系统法 种质转化系统是以植物自身的生殖系统种质细胞为受体进行的转化，如花粉浸泡外源DNA、DNA注射受粉后的子房等； 花粉管通道法：利用植物在受精和胚发育初期接受外源DNA的敏感性 1.外源DNA转化花粉 2.自花授粉后，下柱头，外源DNA滴在柱头，沿花粉管道进入胚囊，转化受精前后的卵细胞 常用植物基因转化方法特点比较 转化方法 农杆菌法 PEG法 电击法 微针注射法 基因枪法 花粉管通道法 受体材料 完整细胞 原生质体 原生质体 原生质体 完整细胞 卵细胞 宿主范围 有 无 无 无 无 有性繁殖植物 组培条件 简单 复杂 复杂 复杂 简单 无 嵌合体比例 有 无 无 无 多 无 操作复杂性 简单 简单 复杂 复杂 复杂 简单 设备要求 便宜 便宜 昂贵 昂贵 昂贵 便宜 工作效率 高 低 低 低 高 低 单子叶植物应用 少 可行 可行 可行 广泛 广泛 （三）受体系统 1.原生质体受体系统:嵌合体 少，易变异，再生频率低 原生质体恢复细胞壁具有分化再生能力，是应用最早的再生受体系统之一。 优点：高效、广泛地摄取外源DNA或遗传物质，获得基因型一致的克隆细胞，所获转基因植株嵌合体少，适用于多种转化系统； 缺点：不易制备、再生困难和变异程度高。 2.愈伤组织受体系统：植体材料经过脱分化培养诱导形成愈伤组织，转化（带有目的基因质粒的农杆菌侵染），分化培养获得再生植株。 愈伤组织易接受外源DNA，转化效率高,适用性广，变异大 优点：外植体来源广，繁殖快，易接受外源基因， 转化效率高。 缺点：遗传稳定性差、嵌合体。因此需要连续的再生系统 3.种质系统：生殖细胞接受外源DNA能力强，转化的基因无显隐性的影响,与育种结合紧密，受季节限制 以生殖细胞如花粉粒、卵细胞等受体细胞进行外源基因转化的系统。 一是利用组织培养技术进行小孢子和卵细胞的单倍体培养、转化受体系统； 二是直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化，如花粉管导入法，花粉粒浸泡法，子房微针注射法等。 4.胚状体再生系统：最理想的基因转化受体系统 体细胞胚使具卵细胞特性的胚性细胞发育而来，接受外源DNA能力强 体细胞单细胞起源，嵌合体少；体胚具两极性，可同时分化根和芽；个体遗传背景一致，可通过反应器大规模生产。 5.直接分化芽受体系统：由未分化的细胞直接分化形成，体细胞元件系变异小，导入的外源基因可稳定遗传。 但易形成嵌合体，转化频率低。 （四）表达和分析 基因水平的检测：RE分析，DNA序列分析，PCR，Southern Blot，RFLP，RAPD等。 翻译水平的检测：ELISA，Western 选择标记基因检测法： 抗生素抗性基因 除草剂抗性基因 报告基因检测法： 冠瘿碱基因 Gus基因(β-葡糖苷酸酶基因) Cat(氯霉素乙酰转移酶基因) (GFP)绿色荧光蛋白基因 Gus基因（β-葡糖苷酸酶基因） 在植物细胞中所产生的葡糖苷酸酶在检测上具有以下特点： ①在一定条件下与X-G1ucuionic acid底物发生作用，产生蓝色沉淀，既可以用分光光度法测定，又可以直接观察到植物组织中形成的蓝色斑点。 ②当加入4-甲基伞形酮基和葡萄糖苷酸时生成4-甲基伞形酮，发荧光（λ=465nm）。因而可以用荧光光谱法测定。由于荧光强度高，本底低，故荧光检测极为灵敏。 三、转基因植物生产药用植物的安全性问题 1.安全性问题 转基因植物存在的用于选择性标记的抗生素，以及导入植物的DNA序列在加工过程中可能出现的改变。 2.环境及生态问题 导入植物的目的基因是否转入其他植物，是否会破坏生态平衡。 第四节 在制药工业上的应用 一、生产天然药物 (1)人参细胞培养 MS培养基 生长初期低糖，生长后期补糖 控制磷酸盐浓度和PH 添加生长素和激动素 离心叶轮式反应器进行 高密度培养 细胞干重最多达30g/L 人参皂苷达2g/L (2)红豆杉细胞培养 紫杉醇(Paclitaxel):二萜类化合物, 抗癌药，是有丝分裂抑制剂，可阻止微管正常生理聚集，抑制癌细胞的有丝分裂和纺锤体的形成，从而使癌细胞的复制受到阻断而凋亡。 1967年美国化学家Wall和Wani首先从太平洋紫 杉（短叶红豆杉）树皮中提取出来。该药1992年底获美国FDA批准上市。 紫杉醇存在于红豆杉属植物的树皮、叶及茎中， 其中树皮中的含量最高。 12000株成年紫杉树中才能提取1KG的紫杉醇，而且紫杉的生长周期很长，在世界分布很少。 紫杉醇的国际市场价格为450美元/g B5培养基，补糖，暗培养 低浓度的生长激素 诱导子 培养基中加甲基戊酸，苯丙氨酸等前体 加甲瓦龙酸等中间产物 加单萜合成抑制剂 筛选细胞株 最高产量达0.15g/L (3)丹参