2010级本科分子生物学实验设计 第一组.pptVIP

实验操作流程 1、清洗红细胞 ：取静脉血2.0ml，放入0.4mlACD抗凝剂的试管中，混匀。吸取0.2ml抗凝剂放入试管中，再加入4ml生理盐水，轻轻摇匀，2500r/min离心5min，倾去上清，重复2--3次。 2、溶血液的制备：向红细胞沉淀中加入溶血剂2.0ml，震荡1min,4 ℃ 10min以上。 3、NADPH的测定：取两只比色杯，一只为测定管，一只为空白管，按下表操作。 4、溶血液中血红蛋白含量的测定 取一支试管加入血红蛋白氧化试剂3.0ml，溶血液0.3ml。混匀，室温放置15min，以血红蛋白氧化试剂调零，读取540nm的吸光度。 实验结果 1、NADPH产量的计算 NADPH产量= —— 2、血红蛋白含量的计算 血红蛋白含量= —— 3: G6PD比活性的计算G6PD比活性单位=—— × 【参考范围】正常值大于2.8U/gHb G-6-PD活性(已校正6PGD)为8.34±1.59U/gHb(37℃) 洗涤红细胞时禁止剧烈震荡，避免溶血。 测定NADPH时读取吸光度的时间要准确。 溶血液制备后应立即测定酶活性或于冰箱保存，否则酶活性易下降。 若采血后不能即时测定，最好加入酸性枸橼酸葡萄糖(ACD)保养液保存。 若当读数△A/min相差较大，应增加读数次数直至△A/min接近为止。 * 年级、专业、班级：2010级·药学·一大班 实验课时间：2012.4.26 实验室：第一实验室 组别：第一大组 组员排名：白当丽、陈可瑜、黄林玉、尹绍青、杨芳、刘娟、马文昌、李永艳。 报告人：马文昌 案例： 患儿，男性，3岁，因面色苍白伴血尿1天入院。1天前食用新鲜蚕豆后，今日出现恶心、呕吐、排尿呈酱油样色，面色苍白。据家长反映，患者的姐姐也曾发生过类似情况。 体格检查：体温38℃，脉搏150次/分，呼吸40次/分，血压80/60mmHg，呼吸急促，神情萎靡，面色苍白，皮肤及巩膜黄染，体型较同龄人瘦小。心、肺未及异常，肝、脾未触及，双肾区无叩击痛，神经系统检查未及异常。实验室检查：红细胞 1.98×1012/L，血红蛋白53g/L，血清总胆红素85.5μmol/L，结合胆红素13.7μmol/L，未结合胆红素71.8μmol/L，尿蛋白（++），潜血(+)，尿胆红素(－)，尿胆素原(+)，尿液镜下未见红细胞。 1.根据上述患儿的临床表现和实验室检查，初步判断患儿是何种疾病？（必答） 2.请设计实验进一步明确诊断。（必答） 要求：实验名称，实验方法，主要试剂和仪器，实验操作流程及注意事项, 结果如何分析。 3. 从生化代谢解释患儿的临床表现和实验室检查结果。（必答） 4. 要想探讨该病发生的分子基础，可以用哪些技术检测什么目的基因？（选答） 5. 患者体型瘦小与该病症是否有关，为什么？（选答） 答：根据上述患儿的临床表现和实验室检查，初步判断患儿为蚕豆病。 蚕豆病的症状：在生吃蚕豆后数小时至数日（1～3天）内突然发热、头晕、烦躁、恶心，尿呈酱油样或葡萄酒色，一般发作2～6天后能自行恢复，但重者若不及时抢救，会因循环衰竭危及生命。与上述患儿的临床表现大致一样，所以初步判断该病为蚕豆病。 蚕豆病是一种六磷酸葡萄糖脱氢酶（G-6-PD）缺乏所导致的疾病，表现为在遗传性葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PD）缺陷的情况下，食用新鲜蚕豆或接触蚕豆花粉后突然发生的急性血管内溶血。 发生机制：在G6PD的作用下能提供足够的NADPH以维持还原型谷胱甘肽（GSH）的还原性（抗氧化作用），有保护正常红细胞免遭氧化破坏的作用，新鲜蚕豆是很强的氧化剂，当G-6-PD缺乏时则红细胞被破坏而致病。  蚕豆病简介 生化书P104 实验名称 :红细胞G6PD活性测定实验方法 : 紫外法 主要试剂： 1 、6mmol/L葡萄糖-6-磷酸二钠(G6P-Na2) : 称取葡萄糖-6-磷酸二钠21.5mg，加10ml 蒸馏水溶解。 2 、2mmol/L NADP+(临用前配制) :称取NADP+ 21.3mg，加10ml 蒸馏水溶解。 3 、0.5mol/LTris-HCl- MgCl2 缓冲液(pH 8.0),:称取12.1g Tris、 MgCl2·6H2O4.06g 加蒸馏水约160ml，溶解，用5mol/LHCl调节pH至8.0 (25℃)最后用蒸馏水定容至200ml。 4、溶血剂：取巯基乙醇0.1mL，10%EDTA2.0mL,6mmol/LNADP+0.4mL,加蒸馏水至总体积200mL。 5、血红蛋白氧化剂(Drabkin试剂):称取K3Fe(CN)6 0.2g，KCN0.