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酶活性测定方法汇编 一、过氧化氢酶活性的测定——J.L.Johnson和K.L.Temple法 1. 主要试剂 （1）0.3%过氧化氢，临时配制 （2）3N硫酸：8.4ml浓硫酸溶于水，定容至100ml。 （3）0.1N高锰酸钾：3.161g高锰酸钾（AR）溶于水，定容至1000ml，于棕色瓶中保存。 2. 操作步骤 称取2.0g过1mm筛孔的风干土壤于125mm的三角瓶中，注入40ml蒸馏水，5ml 0.3%过氧化氢，振荡20分钟，加入5ml 3N硫酸，用滤纸过滤；吸取25ml滤液于100ml 三角瓶中，用0.1N高锰酸钾滴定至微红色（30秒不变），记录高锰酸钾用量V1。同时作对照（不加土壤）试验，高锰酸钾用量为V2。同时做3个空白。 3. 结果计算： Ｍ(0.1mol/L KMnO4 ml/g土)＝（V2—V1）T/g T为校正值 注意事项： 1.N为0.5mol 2.滴定后1分钟，溶液皆褪色，个别溶液呈黄色（滴定高锰酸钾过量？） 二、蛋白酶活性的测定——G.Hoffman和K.Teicher法 1. 主要试剂 （1）2%白明胶水溶液。 （2）甲苯 （3）CaCO3 （4）青色溶液：10g Cu(NO3)2*H2O 溶于700ml水中，加入250g CH3COONa?3H2O，定容。 （5）甘氨酸标准溶液：267.9mg 甘氨酸溶于水，定容至1000ml (50μg/ ml 氨态氮)。 （6）标准曲线：取0~20ml甘氨酸标准溶液，加入20ml水，加2ml 铜溶液，比色测定。 2. 操作步骤 称取10.0g过1mm筛孔的风干土壤于100mlL量瓶中，加入500mg 碳酸钙，1.5ml甲苯。15分钟后，加入20ml 2%白明胶溶液。混合均匀，在37℃恒温箱中放置20小时，用38℃热水稀释至刻度。同时用水代替白明胶作对照。过滤，吸取10ml滤液于50ml 三角瓶中，加入10ml水和2ml铜溶液，定容。用4cm比色皿于650nm处与标准溶液一起测定. 注意事项 1.白明胶水溶液配置时需加热搅拌，且易变质 2.青色溶液配置时需等溶液恢复室温后才能定容（配置所需药品量较大，应做足考虑） 3.所有溶液需同时段显色完全后方能测定 3.结果计算 M(NH2-N mg/g土)= (X样品- X对照- X无基质)×25÷10 三、脲酶活性的测定——E. Hofmann与W. Schmidt法 1. 主要试剂 （1）10% 尿素。 （2）甲苯。 （3）磷酸盐缓冲液：（pH6.7），368g 柠檬酸溶于600ml水中，加入1000 ml 29.5%KOH溶液，定容至2000ml。 2. 操作步骤： 称取10.0g过1mm筛孔的风干土壤于100mlL量瓶中，用1.5ml甲苯处理。15分钟后，加入10ml10%尿素溶液和10ml磷酸盐缓冲液，混合均匀，在37℃恒温箱中放置48小时，用38℃热水稀释至刻度。同时用水代替基质作对照。过滤，吸取10ml滤液于100ml 量瓶中，按氨电极法测定NH2-N的含量。 3. 结果计算 M(NH2-Nmg/g土)=(X样品- X对照- X无基质)×100÷10 注意事项 四、酸性磷酸酶活性的测定 G。Hoffmann 法 1. 主要试剂 （1）甲苯。 （2）苯磷酸二钠溶液：6.75g 苯磷酸二钠(C6H5PO4Na*2H2O)用水溶至1000ml(1ml 含25mg酚) （3）醋酸盐缓冲液(pH5.0)：①0.2mol醋酸溶液：11.55ml醋酸用水溶至1000ml。②0.2mol醋酸钠溶液：16.4g无水醋酸钠用水溶至1000ml。取14.8ml①0.2mol醋酸溶液+35.2ml②0.2mol醋酸钠溶液加水至1000ml。 （4）Gibbs试剂：200mg 2，6-双溴苯醌氯酰亚胺(C6H2Br2ClNO)用乙醇溶至100ml。 （5）酚标准溶液：①原液：1g酚用水溶至1000ml，保存在暗色瓶中。②工作液：取10ml原液用水定容至1000ml（1ml含10μg酚）。 2. 操作步骤： 称取10.0g过1mm筛孔的风干土壤于100mlL量瓶中，用1.5ml甲苯处理。15分钟后，加入10ml苯磷酸二钠溶液和10ml醋酸盐缓冲液(pH5.0),混合。在37℃恒温箱中放置24小时，用38℃热水稀释至刻度。同时用水代替基质作对照。过滤，吸取10ml滤液于50ml 量瓶中，加水至25ml, 加入1ml Gibbs试剂, 混合均匀,放置20分钟,用水定容至刻度，在分光光度计上于578nm处测定颜色的深度。 3. 结果计算： M(phenol mg/g土)=(X样品- X对照- X无基质)×100÷10 注意事项 酚为苯酚 Gibbs应现配现用 土壤磷酸酶活性较强在，则吸取过滤液体为2ml，标液浓度加倍 五、多