蛋白质测定_2.ppt

第二节 蛋白质的定量法 利用蛋白质共性的方法 2、几种测定方法的比较 学习目标 1.了解蛋白质的定量测定方法 2.掌握常量凯氏定氮法、微量凯氏定氮法、含硝食品的测定、以及染料结合法，测定食品中蛋白质含量的原理，和具体操作技能。 1、原理： 样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为CO2和H2O逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用H3BO3吸收。再以标准HCL溶液滴定。根据标准酸消耗量，再乘以换算系数，计算出蛋白质的含量。 样品中含氮有机化合物经浓硫酸加热消化，硫酸使有机物脱水，然后，有机物炭化生成碳；碳将硫酸还原为SO2，本身则变成二氧化碳；二氧化硫使氮还原为氨，本身则氧化为SO3，而消化过程生成的氢，又加速了氨的形成。在反应过程中，生成物水和SO3逸去，而NH3则与硫酸结合成硫酸铵，留在溶液中。 （2）、蒸馏 2、样品的分解条件和各种试剂的作用 （1）氧化剂 （2）硫酸钾或硫酸钠作用 提高溶液的沸点，3400C提高到4000C，加快有机物分解。 K2SO4+H2SO4=2KHSO4 2KHSO4=K2SO4+H2O+SO3 原因: 随着消化过程中硫酸不断地被分解 ，水分不断逸出而使硫酸钾浓度增大 ，故溶液沸点升高。 硫酸铜的作用： C＋ 2CuSO4 → Cu2SO4 ＋ SO2↑＋ CO2↑ CuSO4 ＋ 2H2SO4 → 2CuSO4 ＋ 2H2O ＋ SO2↑ A: 催化剂，加速氧化分解 B: 指示消化终点：待有机物全部被消化完后，这时溶液具有清澈的蓝绿色（如果还有硫酸亚铜存在，溶液将是褐色的。） C: 蒸馏时样品液碱化的指示剂，若所加碱量不足，分解液呈蓝色，不生成氢氧化铜沉淀，需再增加氢氧化钠用量。 3、试剂与仪器： 硫酸、硫酸钾、硫酸铜?、饱和硼酸溶液、 50％氢氧化钠溶液、0.OIN HCL标准溶液 混合指示剂：1体积亚甲蓝和2体积甲基红混合物 凯氏烧瓶、定氮球、三角瓶、量筒、吸量管13、 滴定管、小漏斗 蒸馏：用预先滴有2滴指示剂的60ml硼酸液作吸收液→在凯氏瓶中加50～100ml蒸馏水，玻璃珠数粒→然后从安全漏斗中加入60～ 80ml50% NaOH溶液（至溶液呈蓝黑色为止）→立即接好定氮球→直接火加热蒸馏。 吸收：蒸到凯氏瓶内残液减少到三分之一时，将冷淋管尖端提出液面，然后用蒸汽洗约1min后，用水淋洗尖端→停止蒸馏。 滴定：将接受瓶内的硼酸溶液用0.1N?HCl盐酸标准溶液滴定至终点。 同时做空白样测定（除不加样品，从消化开始操作完全相同）。 5、计 算 （3）消化中火力掌控： 刚开始小火，防止产生的大量泡沫外溢，为了让消化全面，时不时摇动凯氏烧瓶，有时甚至停止加热半小时后，再小火消化。。 （4）消化中加过氧化氢的情况： 如溶液不容易呈透明溶液，可将凯氏烧瓶放冷后，加入30%过氧化氢催化剂2～3ml，促使氧化。 1、原理： 样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为CO2和H2O逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用H3BO3吸收。再以标准HCL溶液滴定。根据标准酸消耗量，再乘以换算系数，计算出蛋白质的含量。 3、微量凯氏定氮法与常量凯氏定氮法的的区别 式中： W—样品质量,g N—盐酸标准液的浓度，mol/L； V1—试剂滴定消耗标准液量，mL； V2—空白滴定消耗标准液量，mL 0.014—氮的毫摩尔质量，g/mmol； 6.25—蛋白质系数。 （2）蒸馏瓶的清洗 思考题： 1 、试述蛋白质测定中，样品消化过程所必须注意的事项，消化过程中内容物颜色发生什么变化？为什么？ 2 、样品经消化进行蒸馏前，为什么要加入氢氧化钠？这时溶液发生什么变化？为什么？如果没有变化，说明什么问题？须采用什么措施？ 3 、 硫酸铜及硫酸钾在测定中起了什么作用？ 1、原理： 2、优点： 避免了以硝酸盐、亚硝酸盐形式存在的氮在凯氏法中消化时生成硝酸和亚硝酸挥发损失。 如凯氏定氮法，称取样品置于凯氏烧瓶中→加入含有2g水杨酸的硫酸30ml，摇动使充分混