汉坦病毒包膜糖蛋白G2重组腺病毒的构建及其在Hela细胞中的表达.pdfVIP

生物 工程 学报 ChinJBiotech2009，October25；25(1O)：1579．1585 journals．im．ac．cn ChineseJournalofBiotechnology ISSN 1000-3061 cjb@im．ao．on @ 2009InstituteofMicrobiology,CASCSM,Allrightsrese~ed 汉坦病毒包膜糖蛋白G2重组腺病毒的构建及其在Hela 细胞中的表达 呼延霆，薛小平，宋凯，汪桦，杨慧，王伟 西北T业大学生命科学院，西安 710072 摘 要：本研究旨在构建可表达汉坦病毒(HTNV)糖蛋白G2的重组腺病毒。应用 PCR方法扩增 G2编码基 因，经 T／A 克隆、测序鉴定后再亚克隆到腺病毒 shuttle载体 pAd5一CMV中并用磷酸钙沉淀法分别将携带 G2编码基 因的重组腺病 毒 shuttle载体与携带报告基因eGFP的腺病毒骨架质粒共转染HEK293细胞，包装、扩增、纯化后得到携带HTNV糖 蛋白G2编码基因的重组腺病毒；用重组腺病毒感染 Hela细胞并收获蛋 白，间接免疫荧光、Westernblotting检测蛋 白表 达。经酶切鉴定表明已成功构建了携带G2基因的重组腺病毒载体；RT-PCR鉴定表明 目的基因能够在感染重组腺病毒 的 Hela细胞 中转录；荧光显微镜观察重组腺病毒感染的 Hela细胞，可见报告基因 eGFP 的表达；间接免疫荧光法和 Westernblotting均证 实表达产物可被抗 G2单克隆抗体所识别，表明糖蛋白G2在感染细胞中得到 了表达。本研究成功 构建 了可表达HTNV包膜糖蛋白G2的重组腺病毒，转染宿主细胞可稳定表达 目的蛋白，为HTNV糖蛋 白G2的结晶、 结构解析研究以及新型汉坦病毒疫苗的研制奠定了基础 。 关键词：汉坦病毒，包膜糖蛋 白G2，重组腺病毒 · · ‘ ■● 1 ‘ · ’ ■ ● - ’ onstructlon 0tarecom binantadenoVlrUScarryingthe HantaanvirusglycoproteinG2geneanditsexpressionin Helacells TingHuyan，XiaopingXue，KaiSong，HuaW ang，HuiYang，andWeiWang FaculytofLifeScience，NorthwesternPloytechnicalUniversity，Xi’an710072，China Abstract：W constructedtherecombinantadenovirusexpressinghteglycoproteinG2ofHantaanvirus．Firstlyweobtainedcoding genefragmentofG2byPCR．andsubsequentlyinsertedhtegeneofinterestintohteAdenoviralpShuttlevectorpAd5一CMV Then WC CO—trnasfectedhterecombinantpShuttlevectorand adenoviursskeletonplasmid intoHEK293cellsby Caleium phosphate precipitationmehtod．AfterhterecombinnatadenovimswerepackagedandamplifiedinHEK293cells，weobservedn1eexpression ofreportergene eGFP b fluorescentmicroscopy,nad we obtained the recombinnatadenoviruscontaining Hnatana viurs glycoproteinG2．Therecombinantadenoviruseswereusedto infcetHelacellsandhteexpressedproteinwasdetcetedbyIndirect Immuno．fluorescence and Western blotting．The constr