狐狸生长激素基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达.pdfVIP

生物工 程 学报 ChinJBiotech2009，October25；25(10)：1470-1476 journals．im．ac．cn ChineseJournalofBiotechnology ISSN 1000-3061 cjb@im．ac．cn @ 2009InstituteofMicrobiology,CASCSM,Allrightsreserved 狐狸生长激素基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达 李巍 ，李秀锦 ，仲飞 ，靳慧君 ，解民，刘玉芝 ，刘龙飞。，苏清洁 1河北农业大学动物科技学院基础兽医部，保定 071001 2燕山大学环境与化学工程学院生物工程系，秦皇岛 066004 摘 要：为制备重组狐狸生长激素(fGH)，采用RT-PCR方法，从银狐垂体中扩增 ，叫 cDNA基 因，利用SnaBI和NotI 位点将f6n基因插入到酵母分泌型表达载体 pPIC9K 中0t一因子信号肽的下游，构建成fGn基因的酵母分泌型表达载体 pPIC9Kf／GH,载体经SalI酶切线性化后，通过电转移将线性化的pPIC9Kf／GH转化到组氨酸缺陷型酵母宿主菌GSl15 中。然后利用不含氨基酸的以葡萄糖为碳源的培养基 (MD)和以甲醇为碳源的培养基(MM)筛选出组氨酸His型和甲醇利 用正型 (Mut)酵母重组体，再经G418加压筛选出高拷 贝fGn基因的重组酵母，经摇瓶发酵培养和 甲醇诱导使 fGH进行 分泌表达。结果表明本实验扩增的fGH基 因序列与 GenBank发表的序列基本一致，发酵液经 SDS—PAGE和 Western blotting检测证明构建的重组酵母能够分泌表达fGH，表达的fGH 占发酵液总蛋白的34％，表达量达 119mg／L发酵液。 关键词：狐狸生长激素，cDNA，毕赤酵母，分泌表达 ，1l’om n‘gand1expressl●onotnt-“oXgrowth·l1’1ormoneRene ■ ’ … ● ‘ inl-tch pastoris WeiLi，XiujinLi，FeiZhong，HuijunJin，MinXie，YuzhiLiu，LongfeiLiu，andQingjieSu 1DepartmentofBasicVeterinaryMedicine，CollegeofAnimalScienceandTechnology,AgriculturalUniversityofHebei，Baoding071001，China 2DepartmentofBiotechnology，CollegeofEnvironmentalandChemicalEngineering，YanshanUniversity，Qinhuangdao066004，hCbta Abstract：Topreparerecombinantfoxgrowthhormone(fGH)，weamplifieditscDNAfrom silverfoxpituitarytissuebvRT．PCR andclonedintoyeastshuttlevectorpPIC9K downsffeam ofQ—factorsignalpeptidesequencebySnaB InadNotIrestrictionsites． herecombinantsceretionvectorpPIC9Kf／GH,linearizedbySalI。wasffansfomrde intohistidine—deficientPicha／pasto嗽 straill GS115byelectroporation．weselectedHis一trnasfomredmethylortopic(His，Mut)yeastusinghistidine—absentmdeiumcontaining dextrose(MD)ormethanol(MM)astheonlycarbonsource，andhtenscreenedtherecombinantGS115wihtmulti．copyfGngenes byG418．，nlesecretiveexpressionoffGH wasperformde undertheinduction ofmehtanolin