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电子显微镜知识整理 电子显微镜与光学显微镜的成像原理基本一样，所不同的是前者用电子束作光源，用电磁场作透镜。另外，由于电子束的穿透力很弱，因此用于电镜的标本须制成厚度约50nm左右的超薄切片。这种切片需要用超薄切片机（ultramicrotome）制作。电子显微镜的放大倍数最高可达近百万倍，有意思的是最初发明电子显微镜的时候，它的放大倍数还不如普通的光学显微镜。??????????????? 光学显微镜、TEM、SEM成像原理比较????????????????? 莱卡超薄切片机???制样技术中还需要负染技术。负染就是用重金属盐（如磷钨酸、醋酸双氧铀）对铺展在载网上的样品进行染色；吸去染料，样品干燥后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而凸的出地方则没有染料沉积，从而出现负染效果。下图是肌动蛋白纤维的负染电镜照片???????????????????? 肌动蛋白纤维的负染电镜照片??? 除了上述两个技术外还有冰冻蚀刻技术（freeze-etching）亦称冰冻断裂（freeze-fracture）。标本置于-100?C的干冰或-196?C的液氮中，进行冰冻。然后用冷刀骤然将标本断开，升温后，冰在真空条件下迅即升华，暴露出断面结构，称为蚀刻（etching）。蚀刻后，向断面以45度角喷涂一层蒸汽铂，再以90度角喷涂一层碳，加强反差和强度。然后用次氯酸钠溶液消化样品，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜（replica）。复膜显示出了标本蚀刻面的形态，在电镜下得到的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构下图是冰冻蚀刻电镜照片，可以看到线粒体、细胞核和细胞膜的几个结构。?????????????? ?冰冻蚀刻电镜照片? ???? 关于电子显微镜的制样技术还有很多，下面简单介绍下电子显微镜常见的几个种类。??? （一）透射电子显微镜???? 在光学显微镜下无法看清小于0.2μm的细微结构，这些结构称为亚显微结构（submicroscopic structures）或超微结构（ultramicroscopic structures；ultrastructures）。要想看清这些结构，就必须选择波长更短的光源，以提高显微镜的分辨率。1932年Ruska发明了以电子束为光源的透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM），电子束的波长要比可见光和紫外光短得多，并且电子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比，也就是说电压越高波长越短。目前TEM的分辨力可达0.2nm。????????????????????? 透射电子显微镜（二）扫描电子显微镜?扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）于20世纪60年代问世，用来观察标本的表面结构。其工作原理是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与电子束入射角有关，也就是说与样品的表面结构有关，次级电子由探测体收集，并在那里被闪烁器转变为光信号，再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。图像为立体形象，反映了标本的表面结构。为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属微粒，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。??????????????????????????????? JEOL扫描电子显微镜??? 值得注意的是扫描电子显微镜下的照片和电子透镜有个很大的不同，它的成像是立体的。?????????????????? 人类血细胞SEM照片????（三）扫描隧道电子显微镜????扫描隧道显微镜（scanning tunneling microscope，STM）由Binnig等1981年发明，根据量子力学原理中的隧道效应而设计。当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（2mV~2V），针尖与样品之间产生隧道效应而有电子逸出，形成隧道电流。电流强度和针尖与样品间的距离有函数关系，当探针沿物质表面按给定高度扫描时，因样品表面原子凹凸不平，使探针与物质表面间的距离不断发生改变，从而引起电流不断发生改变。将电流的这种改变图像化即可显示出原子水平的凹凸形态。扫描隧道显微镜的分辨率很高，横向为0.1~0.2nm，纵向可达0.001nm。它的优点是三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察，而普通电镜只能观察制作好的固体标本。利用扫描隧道显微镜直接观察生物大分子，如DNA、RNA和蛋白质等分子的原子布阵，和某些生物结构，如生物膜??? 不管是哪种电子显微镜它的成像都是黑白的，网上看到的很多彩色的电子显微镜的图像都是经过后期处理的，也就是我们通常说的伪彩色，这是为了更好的说明问题。下图的内质网透射