WB检测方法及常见问题分析.ppt

WB检测方法及常见问题分析 艾碧康生物市场部 钟兴兰 主要内容 WB的基本操作过程和注意事项 WB需要的主要试剂 WB的常见问题及分析 WB基本操作和注意事项 Western Blotting简介 1、标本提取 确定电泳条件 根据待测蛋白状态确定电泳条件： 确定电泳的凝胶浓度 分离的蛋白通过电转膜方式从凝胶中转移到杂交膜上（PVDF，硝酸纤维素或尼龙膜） 选择合适的膜 WB实验原则 设置合适的对照： 阳性对照：明确表达检测蛋白的组织或细胞，用于检测抗体的工作效率 阴性对照：明确不表达检测蛋白组织或细胞，用于检测抗体的特异性 二抗对照：不加一抗，用于检测二抗的特异性 内参对照：检测标本的质量和二抗系统、进行半定量 空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果 Western Blot 需要的主要试剂 WB需要试剂－膜 常用的有PVDF膜，硝酸纤维素膜或者尼龙膜 WB需要试剂－封闭试剂 BSA或者脱脂奶粉 商业化的封闭试剂：如abcam的Protein Block （ab64226） WB需要试剂－一抗 选择适合检测标本种属的一抗（说明书有验证） 选择适用于WB实验方法的一抗（说明书有验证） 选择单克隆抗体或者经过亲和纯化的多克隆抗体 根据说明书推荐的浓度优化最佳稀释比例 WB需要的试剂－内参 内参的选择 杂交需要试剂－二抗 二抗选择：根据一抗来源种属以及抗体Ig亚型选择合适的二抗。 二抗的使用： 根据说明书推荐浓度使用TBST稀释二抗。 如果说明书没有推荐浓度，可进行多个稀释比例进行摸索最佳稀释度（1:1000-1:20000）。 孵育条件一般为室温1-2小时。 杂交需要试剂－底物 显色底物：操作简单，灵敏度低，如TMB、DAB、BCIP/NBT 化学发光底物：灵敏度高，需要曝光检测设备（暗室、曝光设备和胶片）或者凝胶成像设备。 杂交需要试剂－各种溶液 封闭液：一般为含有1-5%BSA或者5%脱脂奶粉的PBS/PBST（0.1M，pH7.4）或TBS/TBST；也可以购买商业化的试剂 稀释液：一般为封闭液或者单独的PBST/TBST，也可以购买商业化的试剂 洗涤液：一般为PBST/TBST，也可以购买商业化的试剂 WB常见问题分析 WB常见问题 没有信号 高背景 非特异性条带 条带大小不对 黑色/灰色背景，白色条带 补丁染色（Patchy staining） ‘Smear’ 没有信号/弱信号 背景高 非特异性条带 Abcam的目标 The Largest Catalogue of the Best Antibodies in the World 全球最大、最高质量抗体的供应商 Abcam公司介绍 成立于1998年，专注于提供高质量的抗体 由英国科学家创立，坐落于剑桥大学校区 2005年获得英女王奖－非常高的荣誉 为全球前5位抗体供应商之一,目前全球知名度和客户的认知度很高 网络市场宣传非常优秀迅速，客户很容易在Abcam网上获取各种实用信息，受到客户的欢迎 接近50000万种抗体，涉及各个研究领域 提供的不仅仅是抗体，更提供抗体相关的一切信息和服务 AbreviewSM 让您与世界同步，与全球客户共享使用心得和经验！ 您可以随时联系其他客户，亲自获取他们的产品使用心得 您可以发表他的使用心得与其他客户分享，同时还可以获得Abpoint！ 黄色米星越多，说明客户推荐值越高！ 其他客户的在线问答 发表文献 AbwireSM－让您随时了解全球最新研究动态！ 最热门的文章 最新的研究进展 最新的参考文献和产品 最新的国际相关会议 ………… 让您时刻走在相关领域的研究前沿！感受到最时尚的研究氛围！！ Abcam Scientific Community 只需在Abcam网站注册，选择您的研究领域，即可成为Abcam Scientific Community一员，轻松享受Abcam提供的服务： 该研究领域最新事件的及时邮件通知 该研究领域最新产品的邮件通知 * 丽春红，转后洗掉再结合抗体 * * * 标本制备 二聚体或者多聚体：增加上样前煮沸变性时间 蛋白不同剪切体或者 isoforms 存在. 蛋白降解：使用新鲜制备的标本，标本中加入新鲜配制的蛋白酶抑制剂 上样量过大：减少上样量 封闭Blocking 封闭不充分：优化封闭时间和封闭试剂浓度 抗体孵育和检测 一抗/二抗浓度过高：降低抗体浓度 抗体没有经过纯化 二抗非特异性结合：使用二抗对照 其他 洗膜保证充分 条带大小不对 标本制备 二聚体/多聚体存在：使用还原变性电泳，除非说明书上有特殊说明 多个亚型存在？（Isoforms） 蛋白降解？ 蛋白修饰 Eg.