7实验七大鼠肝S9的制备.pptVIP

实验六 大鼠肝S9的制备和蛋白含量测定 器材和试剂 器材：低温高速离心机、洁净工作台、匀浆器、注射器、手术剪、低温冰箱、液氮罐等 试剂： 1.17% （0.15M） KCl Tris-HCl缓冲液：6.05g Tris加约80ml蒸馏水溶解，用HCl溶液调pH值至7.4，最后用蒸馏水定容至1000ml 操作步骤 实验动物 大鼠：健康 雄性 成年 SD 或 Wistar 5~6 周 龄 150g左右 1. 苯巴比妥钠 80mg/kg， 腹腔注射，连 续3～5d，最后一次给药后24h后采样。主要诱导P450 2. 戊巴比妥钠 80mg/kg，腹腔注射，连 续3d，第4d采样。主要诱导P450 3.多氯联苯（Aro-clor1254或国产PCB-五氯） 溶剂 玉米油 浓度 200mg/mL 剂量 500mg/kg 方式 腹腔注射 时间 3d 采样 第4d 同时诱导P450和P448 4.β-萘黄酮 玉米油， 80mg/kg，腹腔注射连续3d，第4d采样。主要诱导P448 采样前禁食24h，但可以自由饮水； 断头处死，用75%酒精消毒动物皮部，剖开腹部； 无菌取出肝脏，置平皿中称重，用预冷的0.15M KCl溶液淋洗数次，以便除去能抑制微粒体酶活性的血红蛋白。 弃去淋洗液，将肝脏转入小烧杯，加 0.15M KCl溶液 3mL/g （肝湿重），转入冰浴 用剪刀剪碎肝脏，转入匀浆器 玻璃匀浆器 低于4000r/min，1～2min 或组织匀浆器 20000r/min，1min ※ 以上操作需注意无菌和局部冷环境 离心 肝匀浆 高速离心机 低温 0～4℃ 速度 9000g 离心 10min ※g=1.11×10(-6)R平均×（rpm)2 g 相对离心力 R平均 转头的平均直径，以mm计算 rpm 每分钟转数 上清液即为S9组分 分装 于无菌冷冻管或安瓿中，安瓿 2mL左右。 保存 液氮速冻后置-80℃低温保存。 检查 无菌检查 蛋白含量测定(Bradford法)，每毫升蛋白含量应不超过40mg为宜，因过量蛋白将会抑制回复突变率 生物活性合格 贮存 深低温或冰冻干燥 保存期不超过一年 * * 诱导 采样 肝匀浆制备 S9制备