质粒的提取.docVIP

2.2 农杆菌中目的基因的检测 2.2.1 农杆菌质粒提取 （1）挑取单菌落接种到5 mL的液体培养基中，28℃震荡培养过夜； （2）取2mL的菌液置2 mL的离心管中，于室温，5000 rpm离心10 min，去上清液；再取2 mL菌液于离心管中，重复离心，于室温， 5000 rpm离心10 min； （3）加入0.25 mL溶菌酶溶液，涡旋混匀，置冰浴中30 min； （4）加入0.5 mL LS裂解液，快速颠倒离心管10次，混匀，室温下放置10 min，得清亮粘稠的裂解液； （5）加入0.25 mL TS溶液，快速颠倒离心管10次，置冰浴中1h，生成絮状沉淀； （6）于20℃、12000 rpm离心5 min； （7）转移上清液至离心管中，加入1mL冰冷的无水乙醇，混匀后冰上放置30 min； （8）10000 rpm离心10 min，弃上清液； （9）加入0.4 mL TES溶液，轻弹离心管壁，使沉淀溶解； （10）加入0.4 mL氯仿，颠倒离心管数次混匀，10000 rpm离心3 min； （11）重复氯仿抽提； （12）于氯仿抽提后的上清液中加入2倍体积的冷无水乙醇沉淀质粒DNA，于-20℃保存； （13）在-20℃冰箱放置数小时后，12000 rpm离心5 min，用滤纸吸干液体； （14）加1 ml 70%乙醇，12000 rpm离心5 min；吹干沉淀； （15）