人纤溶酶原K5抑制肝癌血管生成和肿瘤生长作用的结构基础.pdf

中文摘要 人纤溶酶原K5抑制肝癌血管生成和肿 瘤生长的作用及结构基础 专 业：生物化学与分子生物学 博士生：杨 霞 指导老师：高国全教授 朱振字教授 摘要 血管的过程，是肝癌等实体性肿瘤生长和转移的关键环节。新生血管的长入不仅 提供肿瘤生长需要的营养物质和氧气以及带走代谢废物，内皮细胞还为肿瘤组织 生长提供促进因子如FGF—l和FGF-2等，同时新生血管形成更是癌细胞广泛浸润、 转移和肿瘤复发的基础。应用血管增生抑制因子阻断肿瘤新生血管形成的饥饿疗 法为克服肝癌细胞转移和减少肿瘤复发提供了新的视野，有望成为今后肝癌治疗 的突破口。 ． 在已发现的众多的血管抑制因子中，人纤溶酶原K5是目前发现的分子量小、 性质稳定、活性最强的血管增生抑制剂之一。人纤溶酶原(plasminogcn)含有5 个环状结构域(kringles)，每个环由80个氨基酸残基组成，含3个二硫键，形 成双环状构象。水解后可产生一组具有抑制血管增生作用的小分子片段： 5(K5)。血管 1-4)，kringles 1-3和kringles Angiostafin(kringles1-5，kringles 还可抑制内皮细胞的迁移及诱导内皮细胞凋亡。 K5具有治疗血管增生性疾病的潜在临床应用价值和较血管抑素更多的优势， 然而有关K5的实验研究还存在许多问题，主要表现在以下三点：(1)既往有关 中文摘要 K5的实验研究主要集中在血管增生性眼病动物模型上，而有关K5在肿瘤治疗 方面的研究却少有报道：(2)K5完整多肽已获美国专利和中国专利保护，无自 主知识产权；(3)相对于K5功能和潜在临床应用价值的研究，其抑制血管增生 的活性和Kringle结构域中二硫键的位置、数量所决定的内外环结构的关系尚不 明确。 因此，本研究拟从以下三方面解决上述问题：(1)运用基因工程方法获得人 纤溶酶原K5纯化蛋白，在新生血管丰富的肝癌细胞同种种植小鼠和异种种植裸 鼠模型上观察K5抑制肝癌血管生成和肿瘤生长的效应并初步探讨其作用的分子 机制；(2)对K5基因进行改造，获得比K5分子量更小、性质更稳定的K5突 mutantl，K5 变体I(K5 mutl)基因工程纯化蛋白。观察其抑制肝癌血管生成 和肿瘤生长的作用及其效果；(3)根据K5蛋白的结构特征和二硫键分布特点， 构建并表达K5的两个缺失突变体蛋白。在体外细胞模型和体内肝癌皮下种植瘤 模型上分析其抗血管增生活性，从而判断维持K5生物活性所需的最小氨基酸序 列和基本空间结构，明确K5kringle结构域和二硫键与其功能的关系。 主要研究内容和结果如下： 第1部分K5缺失突变体I、Ⅲ的构建及表达纯化 L成功构建K5缺失突变体I、Ⅲ。通过PCR获得的目的基因片段经琼脂糖 mutl 凝胶电泳分析，与预期产物大小相符做理论计算K5为292bp，K5 为258bp，K5 连接无误，阅读框架正确，K5突变体构建成功。 2．获得高纯度可溶性的突变体蛋白。鉴定正确的重组体转化到BL21(DE3)宿 主菌中，经IPTG低温诱导，可表达出可溶性重组蛋白。诱导表达的细菌 Bind Resin亲和柱纯化， 经溶菌酶充分消化后，离心取上清，用Ni2+-His