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氧化应激在亚砷酸钠诱导人永生化角质形成细胞 （HaCaT）适应性反应中的意义 中文摘要 中文摘要 目的 探讨低剂量亚砷酸钠染毒诱导人永生化角质形成细胞(HumanHaCaT Keratinocytes,HaCaT)适应性反应中氧化应激和Keap1/Nrf2-AR 信号通路的表达 及其意义。 方法 1．染毒剂量确定：以HaCaT细胞为研究对象，用0.1、0.15、0.6、2.5、5.0、 10.0、20.0和40.0μM亚砷酸钠(NaAsO)进行细胞染毒，采用MTT细胞增殖及细2 胞毒性检测试剂盒检测细胞增殖率。通过增殖曲线和GraphPadPrism6软件计算亚 砷酸钠染毒半数抑制浓度（halfmaximalinhibitoryconcentration,IC ），从而确定后 50 续诱导适应性反应实验的预处理剂量和冲击剂量。 2．实验分组：将用于实验的HaCaT细胞分为预处理组和无预处理组。预处理 组HaCaT细胞在加入含0.15μM亚砷酸钠的细胞培养液培养24h后，换用含10μM 亚砷酸钠的细胞培养液继续培养0、4、8、12、24和36h；无预处理组待HaCaT 细胞处于生长对数期时，直接换用含10μM亚砷酸钠的细胞培养液继续培养0、4、 8、12、24和36h。 3. 氧化应激指标检测：实验染毒终点收集细胞，采用流式细胞仪检测HaCaT 细胞内活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)水平，采用ELISA方法检测HaCaT细 胞内丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量的变化。 4. Keap1/Nrf2-AR 抗氧化通路相关蛋白检测：实验染毒终点收集细胞，通 过Westernblot方法检测Keap1/Nrf2-AR 信号通路发挥抗氧化作用的关键蛋白核 转录因子红细胞系-2p45(NF-E2)相关因子-2 (nuclear factor erythroid-2p45-related factor2,Nrf2)、Nrf2 的胞浆抑制蛋白Kelch 样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Kelch-like ECH-associatedprotein 1,Keap1)和Nrf2 的胞核竞争蛋白BTB-CNC 异体同源体 1(BTBandCNChomology 1,BACH1)在HaCaT细胞胞浆和胞核中的表达情况，以 及 HaCaT 细胞中抗氧化相关酶类的表达情况，包括血红素单加氧酶(heme oxygenase 1,HO-1)蛋白水平和细胞总超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD) 活力改变情况。 I 中文摘要 氧化应激在亚砷酸钠诱导人永生化角质形成细胞 （HaCaT）适应性反应中的意义 结果 1．不同剂量亚砷酸钠对HaCaT细胞增殖的影响：与无预处理组相比，≤2.5μM 亚砷酸钠染毒组HaCaT细胞相对增殖率增加，其 0.15μM组的增殖率增加最明 显，差异具有统计学意义(P0.05)；大于2.5μM亚砷酸钠染毒组HaCaT细胞相对 增殖率明显减小(P0.05)，计算得亚砷酸钠IC 为9.077μM。 50 2．低剂量亚砷酸钠诱导HaCaT细胞ROS和MDA 的改变：随着亚砷酸钠染 毒时间的延长，预处理组HaCaT细胞内ROS和MDA水平先上升后下降，其 ROS水平在12h达到峰值，MDA水平在24h达到峰值，均比无预处理组ROS和 MDA水平达到峰值时间（分别为8h和 12h）要延后，并且ROS和MDA 的峰值 水平显著低于无预处理组(P0.05)。 3．低剂量亚砷酸钠诱导HaCaT细胞Keap1/Nrf2-AR 通路表达的改变： （1）亚砷酸钠染毒不同时间对转录因子Nrf2蛋白水平的影响：随着亚砷酸钠染 毒时间的延长，预处理组HaCaT细胞核 Nrf2 蛋白水平随染毒时间延长呈先下降 后上升趋势，在8h达到峰值，峰值时间比无预处理组（12h）提前，并且峰值水 平高于无预处理组，差异具有统计学意义(P0.05)；另外，预处理组细胞核Nrf2 蛋白在8h的水平明显