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核糖核酸酶---核糖核酸酶A 核糖核酸酶A（RNase A）：内切核糖核酸酶，来源于牛胰脏。 切割机制：攻击RNA上嘧啶碱基的3’端。 反应条件极宽，极难失活。 低盐浓度（0-100mM）: 切割单链和双链RNA； 切割DNA:RNA杂交体中的RNA。 高盐浓度（≧300mM）: 特异切割单链RNA。 可被胎盘RNA酶抑制剂（RNasin）或氧钒-核糖核苷复合物（VRC）抑制。 用途： 从DNA：RNA杂交体中去除未杂交的RNA区。 确定RNA或DNA中的单碱基突变的位置。 RNA检测----核糖核酸酶保护分析法。 降解DNA制备物中的RNA分子。 核糖核酸酶---核糖核酸酶T1 核糖核酸酶T1（RNase T1）：内切核糖核酸酶，来源于米曲霉。 切割机制：攻击RNA上鸟嘌呤核苷酸3’端磷酸。 反应条件极宽，极难失活。 类似于核糖核酸酶A。 核糖核酸酶---核糖核酸酶H 核糖核酸酶H（RNase H）：来源于小牛胸腺组织。 特异降解DNA:RNA杂交双链中的RNA链。 用途： 与DNA聚合酶I和DNA连接酶共同参与cDNA第二条链的合成。 mRNA cDNA第一链 mRNA 反转录 RNase H 5’ 3’ 5’ 3’ dNTP DNA 聚合酶I 5’ 3’ 5’ 3’ DNA连接酶 cDNA第一链 cDNA第二链 脱氧核糖核酸酶I 脱氧核糖核酸酶I（DNase I）：源于牛胰脏，一种糖蛋白，通常得到的是几种同工酶的混合物。 切割机制：从嘧啶核苷酸5’端磷酸随机降解单链或双链DNA。 Mg2+存在条件下，能在DNA双链上随机独立的产生切口。 Mn2+存在条件下，在双链DNA大致同一位置上切割产生平头端DNA 用途： 与DNA聚合酶I一起参加切口平移。 Mn2+存在下，用鸟枪法制作DNA文库，用于测序。 DNase I足迹法。 去除转录产物中的模板DNA DNase I足迹法 S1核酸酶 S1核酸酶：源于米曲霉菌，含锌蛋白质，相对耐热。 反应需要Zn2+和酸性条件（pH4.0-4.5）。 降解单链DNA或RNA 降解方式为内切或者外切 酶量过大时，伴有双链核酸的降解，活性很小。 用途： 切掉DNA片段的单链突出末端产生平头末端； 双链cDNA合成时切除发夹结构； S1核酸酶作图：测定杂交分子的杂交程度、RNA分子定位、确定内含子位置、内含子剪切位点定位、转录起始终止位点测定等。 S1核酸酶作图法 引物延伸法 2.6 核酸外切酶 分类：作用于单链；作用于双链；既可作用单链又可作用双链。 用途： 大肠杆菌核酸外切酶VII：内含子和外显子位置测定等。 大肠杆菌核酸外切酶III：与S1核酸酶联合用于大片段测序。 Bal 31核酸酶：大片段测序 2.7 T4噬菌体多核苷酸激酶 pse T基因编码，具有激酶活性和磷酸酶活性。 5’激酶活性：正向反应和交换反应。 3’磷酸酶活性 用途： DNA或RNA 5’末端标记。 用于连接反应的5’-磷酸的添加。 正向反应和交换反应 2.8 碱性磷酸酶 两类碱性磷酸酶： 细菌碱性磷酸酶（BAP）和小牛肠碱性磷酸酶（CIP）。 催化核酸分子的 5’端脱磷酸。 用途： 5’末端标记前的处理； 去除DNA片段的5’端磷酸，防止自身连接。 5’ RACE中利用CIP去除非mRNA的5’-磷酸。 利用碱性磷酸酶的5’ RACE 人有了知识，就会具备各种分析能力， 明辨是非的能力。 所以我们要勤恳读书，广泛阅读， 古人说“书中自有黄金屋。 ”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识， 培养逻辑思维能力； 通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平， 培养文学情趣； 通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。 有许多书籍还能培养我们的道德情操， 给我们巨大的精神力量， 鼓舞我们前进。 * 成斑率(平板效率)(efficiency of plating,EoP) * 平末端连接的技巧介绍 * 用于制备杂交探针 * 2 基因工程工具酶 2.1 限制性核酸内切酶 2.2 连接酶 2.3 DNA聚合酶 2.4 末端转移酶 2.5 核酸酶 2.6 核酸外切酶 2.7 T4噬菌体多核苷酸激酶 2.8 碱性磷酸酶 2.1 限制性核酸内切酶 E coli B E coli K λ. K λ. B EOP=1 EOP=1 EOP=10-4 EOP=1