常用分子生物学技术的原理及应用STZ.ppt

荧光素酶报告基因系统Luciferase Report Gene System f．得到纯合体： 由于同源重组常常发生在一对染色体上中一条染色体中,所以如果要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型，需要进行至少两代遗传。 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。 该方法通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的，克服了随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。 直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。 利用随机插入突变进行基因敲除 此法利用某些能随机插入基因序列的病毒，细菌或其他基因载体，在目标细胞基因组中进行随机插入突变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞。 基因捕获法是最近发展起来的利用随机插入突变进行基因敲除的新型方法 。 技术原理： 插入载体的选择： 根据细胞的不同，插入载体的选择也有所不同。 1 逆转率病毒可用于动植物细胞的插入； 2 植物细胞中农杆菌介导的T-DNA转化和转座子比较常用； 3）噬菌体可用于细菌基因敲除。 基因捕获法的优点  面对人类基因组计划产生出巨大的功能未知的遗传信息，传统的基因敲除方法显得有些力不从心。因此，基因捕获法应运而生，利用基因捕获可以建立一个携带随机插入突变的ES细胞库，节省大量筛选染色体组文库以及构建特异打靶载体的工作及费用，更有效迅速地进行小鼠染色体组的功能分析。  基因捕获法的缺点 只能剔除在Es 细胞中表达的基因。 用基因捕获法进行基因剔除的另一个缺点是无法对基因进行精细的遗传修饰。 RNAi引起的基因敲除 RNAi基因敲除的优点及应用  ①.比用同源重组法更加简便，周期大大缩短。  ②.对于哺乳动物，如对于一些敲除后小鼠在胚胎时就会死亡的基 因，可以在体外培养的细胞中利用RNAi技术研究它的功能。 ③.由于RNAi能高效特异的阻断基因的表达，它成为研究信号传导通路的良好工具。  ④.RNAi还被用来研究在发育过程中起作用的基因，如可用RNAi来阻断某些基因的表达，来研究他们是否在胚胎干细胞的增殖和分化过程中其起着关键作用。 基因敲除技术的应用 ①．建立生物模型 在基因功能，代谢途径等研究中模型生物的建立非常重要。基因敲除技术就常常用于建立某种特定基因缺失的生物模型，从而进行相关的研究。这些模型可以是细胞，也可以是完整的动植物或微生物个体。最常见的是小鼠。 ②.提供廉价的异种移植器官 众所周知，器官来源稀少往往是人体器官移植的一大制约因素，而大量廉价的异种生物如猪等的器官却不能用于人体。这是因为异源生物的基因会产生一些能引起人体强烈免疫排斥的异源分子，如果能将产生这些异源分子的基因敲除，那么动物的器官将能用于人体的疾病治疗，这将为患者带来具大的福音。 ③疾病的分子机理研究和疾病的基因治疗 通过基因敲除技术可以确定特定基因的性质以及研究它对机体的影响。这无论是对了解疾病的根源或者是寻找基因治疗的靶目标都有重大的意义。 对于日益威胁人体健康的肿瘤而言，它的产生多是抑癌基因突变的结果，因此，可应用基因敲除技术制备人类癌症的鼠模型。同时，应用RNAi技术可以特异地杀伤带有异常基因的肿瘤细胞。 基因敲除技术还可用于治疗遗传病，包括去除多余基因或修饰改造原有异常基因以达到治疗目的。 ④免疫学中的应用 同异源器官移植相似，异源的抗体用于人体时或多或少会有一定的免疫排斥，使得人用抗体类药物的生产和应用受阻。而如果将动物免疫分子基因敲除，换以人的相应基因，那么将产生人的抗体，从而解决人源抗体的生产问题。  ⑤改造生物、培育新的生物品种 细菌的基因工程技术是本世纪分子生物学史上的一个重大突破，而基因敲除技术则可能是遗传工程中的另一重大飞跃。它为定向改造生物，培育新型生物提供了重要的技术支持。 荧光蛋白 2008年10月8日 诺贝尔化学奖揭晓 荧光蛋白的始祖 —— GFP 原来，在这种水母的体内有一种叫水母素的物质，在与钙离子结合时会发出蓝光，而这道蓝光未经人所见就已被一种蛋白质吸收，改发绿色的荧光。这种捕获蓝光并发出绿光的蛋白质，就是绿色荧光蛋白。 GFP由238个氨基酸分子组成，分子量为26.9 kDa。 来源于水母的野生型GFP在395 nm和475 nm分别有主要和次要的激发峰，它的发射峰在509 nm，处于可见光谱的绿色区域；来源于海肾的GFP只在498 nm有单个激发峰。 GFP是典型的β桶形结构，包含β折叠和α螺旋，将荧光基团包含在其中。严密的桶形结构保护着荧光基团，防止它被周围环境淬灭，内部面向桶形的侧链诱导Ser65–Tyr