SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳摘要.ppt

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量 实验 实验原理 电泳：指带粒子在电场中向与自身所带电荷相反的电极移动的现象。 影响电泳的因素： 不同的带电颗粒在同一电场中泳动的速度不同。常用泳动度(或迁移率)来表示。泳动度是指带电颗粒在单位电场强度下泳动的速度。 带电颗粒的性质：即颗粒所带净电荷的数量，大小及形状； 环境的影响：包括电场强度，溶液的性质(pH值，离子强度，粘度等)，电渗作用；支持物筛孔的大小等。 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)： 以聚丙烯酰胺凝胶作为支持物的一种区带电泳。 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体(Acr)和交联剂N,N’-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在有引发剂过硫酸铵(SP)和增速剂N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)的情况下聚合而成的。 在聚合过程中，TEMED催化AP产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状立体结构。 聚丙烯酰胺凝胶的特性： 聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以通过改变丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的浓度来控制。丙烯酰胺的浓度可以在3～30％之间。低浓度的凝胶具有较大的孔径，高浓度凝胶具有较小的孔径。当相对分子质量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离时，阻滞的程度不同，因此表现出不同的迁移率，称为分子筛效应。 凝胶孔径可调节，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径，从而得到不同的有效孔径，用于分离不同分子量的生物大分子。 分辨率高，能把分子筛作用和电荷效应结合在同一方法中，因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。 由于聚丙烯酰胺凝胶是由－C－C－键结合的酰胺多聚物，侧链只含有不活泼的酰胺基团而且无其它离子，化学惰性好，电泳时不会产生“电渗。 透明度好，便于照相和复印。机械强度好，有弹性，不易碎，便于操作和保存。 不连续的凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳又常分为两大类，第一类是连续的凝胶电泳，第二类是不连续的凝胶电泳。 　连续系统电泳体系中缓冲液、pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。 浓缩效应可显著提高聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨率，该效应可通过引入浓缩胶和不连续缓冲溶液系统而获得。 浓缩胶处于分离胶的顶部，因此样品在进入分离胶之前首先要经过浓缩胶。它是由较低浓度的丙烯酰胺构成，当样品经过浓缩胶时由于胶内网孔较分离胶网孔大，样品的移动速度较快，最终使样品“堆积”在浓缩胶和分离胶之间。 另外，浓缩胶还具有比分离胶更低的pH。浓缩胶内的缓冲溶液是Tris-HCl（pH 6.7)，分离胶内的缓冲溶液是pH 8.8的Tris-HCl，而电泳正负两极的缓冲溶液均为pH 8.3的Tris-甘氨酸缓冲溶液。在浓缩胶中，小分子并带有大量负电荷的Cl-在凝胶中的移动速率较快，而电荷较少且分子量较大的甘氨酸的移动速率较慢。由于二者在同一电场中，具有相同的电流，由此形成的电压梯度导致甘氨酸离子始终跟随在Cl-的后面，带有负电荷的蛋白质样品则浓缩在甘氨酸离子和Cl-之间向正极移动。当样品进入pH 8.8的分离胶时，甘氨酸的解离度增加，在电场中的迁移率高于样品，蛋白质不再夹于两种离子之间向正极移动，这时的蛋白质依靠分子筛效应和电荷效应进行分离。 不连续的凝胶电泳的原理： 三个不连续性：凝胶孔径的不连续；缓冲液离子组成及各层凝胶pH的不连续；在电场中形成的电位梯度的不连续。 三种物理效应：电荷效应；分子筛效应；浓缩效应。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS(十二烷基硫酸钠)，是一种阴离子表面活性剂 ，在一定条件下它能打开蛋白质氢键和疏水键，并按比例地结合到这些蛋白质分子上形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，每克蛋白质一般结合1.4克SDS。SDS与蛋白质的定比结合使蛋白质-SDS复合物均带有相同的负电荷，其量远远超过蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了蛋白质间原有的电荷差异。 蛋白质-SDS复合物在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒。不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，约为1.8nm，而长轴则随蛋白质的分子量成正比变化。 蛋白质-SDS复合物在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是取决于椭圆棒的长度，也就是蛋白质相对分子质量。 当蛋白质的分子量在15～200KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈直线关系，符合下列方程式