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第四篇 遗传与变异 23 重组DNA技术 23 重组DNA技术 重组DNA技术,也称基因工程或遗传工程。 基因工程是指将特定的基因(即外源基因),通过载体或其它手段送入受体细胞,使它们在受体细胞中与受体细胞的基因进行重组,并能增殖、表达,这样一种遗传学操作。 基因工程的主要目的:通过与优良性状相关的基因的重组,获得具有高度应用价值的新物种或新产品。 23 重组DNA技术 23.1 基因工程的相关技术 23.1.1 核酸的分子杂交 1. DNA的变性与复性 DNA变性 较高温度DNA解链成单链。 DNA复性 变性的DNA逐渐冷却,分离的两条单链通过碱基互补配对重新恢复成双链的DNA分子。 短链容易精确复性;长链复性较难。 杂交分子 不同来源的单链DNA,只要碱基序列大部分互补,就可以复性。 DNA与RNA之间,也一样可以通过碱基互补配对形成杂交双链分子。 23 重组DNA技术 2. 分子探针寻找特定基因 放射性标记的DNA或RNA分子。 3. Southern印迹 可以检测特定的DNA序列。 23 重组DNA技术 4. Northern印迹 可以检测特定基因的表达情况。 5. 原位杂交 可以检测特定细胞中某一基因的表达情况。 23 重组DNA技术 23.1.2 PCR 1. PCR技术的基本原理 PCR反应过程: ●双链DNA变性(90℃~95℃)成为单链DNA; ●引物复性(37℃-60℃)同单链DNA互补序列结合; ● DNA聚合酶催化(70℃~ 75℃)使引物延伸。 23 重组DNA技术 2. Taq DNA聚合酶 耐热 3. 寡核苷酸引物 4. PCR技术的应用 基因克隆、特定DNA序列鉴定(基因鉴定、DNA指纹识别) 23 重组DNA技术 23. 2 基因工程主要的工具酶 23.2.1 限制性内切(核酸)酶 (1)限制性内切酶的作用 识别DNA中特定核苷酸序列,使每条链的一个磷酸二酯键断开。 (2)限制性内切酶的类型 I型、II型和III型。 II型酶→基因工程。 (3)限制性内切酶的命名 根据来源命名。如EcoR I →大肠杆菌(E. coli)、R株系、第一种。 23 重组DNA技术 (4)限制性内切酶的识别序列 能识别的特定核苷酸序列。 4~6个碱基对组成,且碱基互补对称。 只写单链的核苷酸序列。 (5)限制性内切酶的切割位点 II型酶切割位点在识别序列区内。 23 重组DNA技术 (6)切割片段的末端 A.粘性末端 两条链末端交错对称。 ● 5 粘性末端 ● 3 粘性末端 B.平头末端 两条链末端平齐。 23 重组DNA技术 23.2.2 DNA连接酶 催化-PO4和-OH形成磷酸二酯键。 (1)E. Coli DNA连接酶 大肠杆菌(E. Coli)基因组编码; 连接具互补粘性末端的DNA片段。 (2)T4 DNA连接酶 T4噬菌体DNA编码; 既连接具互补粘性末端的DNA片段,也能连接平头末端。 23 重组DNA技术 23.2.3 反转录酶 从反转录病毒中制备得到的。 该酶能以具有3′-OH 的DNA或RNA为引物,以mRNA为模板从5′→3′聚合生成cDNA 。 23 重组DNA技术 23.3 基因(克隆)的质粒载体 基因载体 运送外源DNA片段进入受体细胞。 需具备三个条件:●有插入位点; ●能在受体细胞内复制; ●有筛选标记基因。 23 重组DNA技术 质粒 A.存在于细菌;蓝藻、绿藻、真菌。 B.染色体外裸露环状双链DNA分子,小的不足1500bp,大的100kb以上。 C.宿主细胞内能自主复制。分为松弛型和严紧型复制两种类型质粒。选用分子小和松弛型复制的质粒(即有高的拷贝数)。 23 重组DNA技术 质粒载体pBR322 A.有复制起始点,能在受体细胞内复制; B.有2种筛选标记基因; C.有允许外源DNA插入的位点; D.有高的拷贝数。 23 重组DNA技术 23.4重组DNA的基本步骤 23.4.1 获得目的基因 1. 构建基因组文库分离目的基因 2.人工合成DNA 3.利用反转录酶构建cDNA文库分离目的基因 4.用PCR技术从基因组中扩增特定的基因片段 23 重组DNA技术 23.4.2 DNA分子的体外重组 酶切和连接。 23 重组DNA技术 23.4.3 重组DNA分子引入宿主细胞和筛选鉴定 1. 重组DNA引入宿主细胞 原核生物细胞是很好的受体细胞→容易摄取外界的DNA,增殖快,基因组简单,便于培养和基因操作。大肠杆菌、蓝藻、农杆菌等。 2. 重组体克隆的筛选与鉴定 抗性筛选;鉴定的证据越充分越好。 2
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