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生物活性小分子与靶点相互作用研究中的新方法和新技术唐功利　麻锦彪　吴厚铭　陈海宝摘要?活性小分子与靶蛋白的相互作用是生命中基本的相互作用之一, 因而靶蛋白和活性小分子的筛选是生命有机化学及药物化学研究的重要内容. 在活性小分子筛选方面, 细胞印迹(cytoblot)、以核磁共振为基础的结构活性关系研究(SAR-by-NMR)及反双杂交(reverse two-hybrid)系统分别是以细胞、靶蛋白及蛋白间的相互作用为靶点的高通量、快速的筛选方法. 另外, 在由活性小分子鉴定靶蛋白的研究中, 三杂交(three-hybrid)系统、功能表达克隆(functional expression-cloning)及药物印迹(drug-western)等方法大大加速了靶蛋白的鉴定进程; 而展示克隆(display cloning)方法可以直接完成由活性小分子到靶蛋白基因的克隆. 结合DNA芯片技术, 以基因组为基础的筛选方法同时还可以明确小分子参与的一系列生物大分子调控. 而小分子印迹(small molecular printing)是从组合化学出发适应人类基因组要求的筛选靶蛋白及活性小分子、研究小分子参与调控的方法. 概要介绍这几种最新筛选方法, 并对中草药现代化进行了初步探讨.?关键词?靶蛋白 活性小分子 筛选 细胞印迹 SAR-by-NMR 反双杂交 三杂交 功能表达克隆 药物印迹 展示克隆 小分子印迹 化学基因学 中草药现代化　20世纪90年代, 随着分子生物学和有机化学的飞速发展, 人类基因组计划的全面展开, 越来越多的有机化学家尝试通过活性有机小分子来探索生物大分子的功能及调控, 从而从分子及化学键的水平揭示生命活动的本质. 于是一门融合了化学及生物学的交叉学科棗化学生物学应运而生. 与此同时, 随着人类基因组学及蛋白组学的发展, 以活性有机小分子为探针来研究基因表达及细胞周期调控的化学基因学(chemical genetics)[1～4]正逐步形成. 在这些研究中, 从生物活性小分子出发寻找它们的生物靶分子, 或从生物靶蛋白出发寻找高亲和性配体分子, 是当前研究活性小分子与生物靶分子相互作用、分子识别、信息传递、生命过程的小分子调控机制及发现新颖药物的关键环节. 最近这一领域出现了一系列新概念、新方法和新技术, 如细胞印迹, SAR-by-NMR, 反双杂交技术, 三杂交系统, 功能表达克隆, 药物印迹, 展示克隆, DNA芯片技术及小分子印迹等. 本文结合化学基因学, 主要介绍这几种最新筛选方法的原理、特点及在发现活性小分子和靶蛋白方面的应用.　1 活性小分子的筛选　有机化学, 特别是组合化学可以方便地创造数量极其庞大的小分子化合物库, 但是以往如何从这庞大的化合物库中筛选到期望的活性分子却面临很大的困难, 缺少灵敏、有效且可快速筛选的方法及手段是当时的主要障碍. 下面介绍的最近发展的几种高通量、快速而灵敏的筛选活性小分子的方法也许是对克服上述困难的有益的探索.?　1.1?高通量活性小分子的筛选 棗 细胞印迹　细胞印迹(cytoblot)[5], 即高通量整细胞免疫检测(high-throughput whole-cell immunodetec- tion assay), 是在酶偶联免疫吸附测定(ELISA)和免疫印迹 (western blotting)的基础上发展起来的. 该方法用于快速检测小分子对DNA合成、蛋白翻译后加工(乙酰化、磷酸化等)及细胞周期等的影响. 其基本原理与免疫印迹十分类似(图1), 但是检测某一类细胞中的分子是在多孔培养板上的整细胞水平进行的. 首先以待检测的分子作为抗原制备抗体, 即一抗; 然后选择合适的二抗进行检测, 如采用联有辣根过氧化酶的二抗与一抗偶联, 形成的复合物通过加入氨基苯二酰一肼(luminol)、过氧化氢和对碘苯酚进行检测. 若细胞中有待检测的分子(即抗原)存在, 则引发的化学发光反应使底片感光; 若不存在, 则无发光反应. 5-溴尿嘧啶是一种化学诱变剂, 在DNA复制过程中, 它的渗入可使原来的A-T配对转变为G-C配对, 从而导致癌变. 凡是可以阻止5-溴尿嘧啶渗入的化合物在一定程度上具有抗癌作用. Stockwell等人[5]采用细胞印迹法在6144孔细胞培养板上验证了已知的抗癌药如转化生长因子-β(transforming growth factor β)、噻氨酯哒唑(nocodazole)等阻止5-溴尿嘧啶渗入DNA合成的情况, 以此建立了细胞印迹筛选活性小分子的方法. 其最大的优点是能够进行活性小分子的高通量快速筛选, 可以采用组织特异的细胞在纳升到毫升的规模培养. 但该方法一般适合于初筛, 要进一步明确所得小分子的活性还需结合其他筛选方法.图1 细胞印迹原理示