1.2-基因工程操作流程-2013.ppt

* * 1. cDNA(complementary DNA):是指经反转 录合成的，与RNA互补的单链DNA。以单链cDNA为模板，经聚合反应可合成双链cDNA。 2. 基因组DNA（genomic DNA）：是指代 表一个细胞或生物体整套遗传信息（染色体 及线粒体）的所有DNA序列。 * M： DNA Marker； 1：阳性对照；2-3：转化植株； 4：空白对照；5：未转化植株 （一）原核细胞的基因结构（补） 非编码区 非编码区 编码区 编码区上游 编码区下游 与RNA聚合酶结合位点 启动子 终止子 启动子--一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位。 终止子--也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端，使转录在所需要的地方停止下来。 为什么RNA聚合酶能够仅在启动子处结合呢? 启动子处的核苷酸顺序具有特异的形状以便与RNA聚合酶结合，就好像酶与其底物的结构相恰恰适合一样。将100个以上启动子的顺序进行了比较，发现在RNA合成开始位点的上游大约10bp和35bp处有两个共同的顺序，称为-10和-35序列。这两个序列的共同顺序如下，-35区“AATGTGTGGAAT”，-10区“TTGACATATATT”。大多数启动子均有共同顺序（consensus sequence)，只有少数几个核苷酸的差别。 终止子 能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质 编码区: 非编码区: 原核细胞的基因结构 有调控作用，含启动子、终止子等。 非编码区 非编码区 编码区 编码区上游 编码区下游 启动子 终止子 （二）真核细胞的基因结构(补) 编码区 非编码区 非编码区 与RNA聚合酶 结合位点 内含子 外显子 能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做内含子 启动子 终止子 编码区上游 编码区下游 内含子： 外显子： 原核细胞 真核细胞 不同点 编码区是 _____的 编码区是间隔的、_____的 相同点 都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的 原核细胞与真核细胞的基因结构比较 连续 不连续 编码区 非编码 1.2基因工程的基本操作程序 ①从细胞中分离出DNA ① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ②限制酶截取DNA片断 ③分离大肠杆菌中的质粒 ④ DNA重组 ⑤用重组质粒转化大肠杆菌 ⑥培养大肠杆菌克隆大量基因 基因工程的基本操作程序 目的基因的获取 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定 目的基因——主要指编码蛋白质的结构基因, 也可以是一些具有调控作用的因子。 取 出DNA 用限制酶切断DNA 目前被较广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素基因、种子贮藏蛋白基因、植物抗病基因等。 1. 目的基因的获取 基因文库的种类： 基因组文库：含有一种生物所有的基因 部分基因文库：含有一种生物的一部分基因（如：cDNA文库） 获取目的基因的方法一：从基因文库中获取目的基因 基因文库（gene library）的概念： 将含有某种生物的不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。 组织或细胞染色体DNA 限制性核酸内切酶 DNA片段 重组DNA分子 含重组分子的转化菌 载体 受体菌 基因组文库 存在于转化细菌内，由载体所携带的所有基因组DNA的集合。 mRNA 逆转录酶 c DNA 双链cDNA 重组DNA分子 载体 含重组分子的转化菌 受体菌 用某种生物发育的某个时期的mRNA制备双链的cDNA后，建立的基因文库。 cDNA文库 文库类型 cDNA文库 基因组文库 文库大小 小 大 基因中启动子（具有启动作用的DNA片段） 无 有 基因中内含子（位于编码蛋白质序列内的非编码DNA片段） 无 有 基因多少 某种生物的部分基因 某种生物的全部基因 物种间的基因交流 可以 部分基因可以 PCR(polymerase chain reaction) ——多聚酶链式反应 是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过此技术，可获取大量的目的基因。 获取目的基因方法二：利用PCR技术扩增目的基因 PCR扩增仪 原理：DNA双链复制 反应过程： 1. 变性：将反应系统加热至90 ℃ -95℃ ，使模板DNA完全变性成为单链； 2. 退火：将温度下降至55℃- 60℃左右，使引物与模板DNA退火结合； 3. 延伸：将温度升至70℃- 75℃ ，DNA聚合酶 以dNTP为底物催化DNA的合成反应。 上述三个步骤为一个循环，经25～30次循