RNA的提取和cDNA合成與realtimePCR-100125.docVIP

RNA的提取，cDNA合成及realtime PCR RT- PCRcDNA合成RNA提取 RT- PCR cDNA合成 RNA提取 或realtime PCR 或 realtime PCR 一：RNA提取 1．RNA提取中应该注意的事项 模板mRNA的质量直接影响到cDNA合成的效率。由于mRNA分子的结构特点,容易受RNA酶的攻击反应而降解,加上RNA酶极为稳定且广泛存在,因而在提取过程中要严格防止RNA酶的污染,并设法抑制其活性,这是本实验成败的关键。所有的组织中均存在RNA酶,人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染，因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃ 细胞内总RNA制备方法很多,如异硫氰酸胍热苯酚法等，许多公司有现成的总RNA提取试剂盒,可快速有效地提取到高质量的总RNA。本实验室采用Trizol?试剂进行总RNA的提取，纯化的mRNA在70%乙醇中-80℃可保存一年以上。 2．RNA提取所需要准备的试剂及器材 1）试剂 三氯甲烷、异丙醇、DEPC水（配制方法参考分子克隆）、75%乙醇（用经DEPC处理的去离子水配制） 2）设备及器材 真空泵、分光光度计、匀浆器（用于组织来源的样本）、冰浴、RNase-free的eppendorf管、RNase-free的枪头、一次性手套、一次性口罩、一次性帽子。 3．RN