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第九章 分子生物学技术检测微生物 主要内容 第一节 核酸探针技术检测食品微生物（第六章p108） 第二节 PCR技术检测食品微生物（第七章p121） 第三节 环介导等温扩增技术检测食品微生物（第八章p161） 第四节 基因芯片技术检测食品微生物（第九章p172） 第一节 核酸探针技术检测食品微生物 一、探针的定义 定义：探针(probe)，是指与特定的靶分子发生特异性相互作用，并可被特殊的方法探知的分子。 类型：抗体-抗原、生物素-抗生物素蛋白、生长因子-受体核酸探针：是指带有标记物的已知序列的核酸片段，它能和与其互补的核酸序列杂交，形成双链，所以可用于待测核酸样品中特定基因序列的检测。 二、核酸探针的工作原理 两条碱基互补的DNA链在适当条件下按碱基配对原则形成杂交DNA分子。根据DNA遗传序列的相对稳定性和互补原则，用已知特异的碱基序列作成有标记的一小段单链(或核苷酸序列)与被检测材料进行分子杂交。如果被检测材料中病原的遗传序列与探针具有互补的碱基序列，就会形成杂交双链，从而证明它们之间具有一定程度的同源性。（p108） 三、核酸探针的种类 （一）按来源及性质划分　 1.基因组DNA探针 2.cDNA探针 3.RNA探针 4.寡核苷酸探针 （二）按标记物划分 1.放射性标记探针：用放射性同位素做为标记物 2.非放射性标记探针：生物素(Biotin)和地高辛(digoxigenin)。 四、核酸探针的制备方法（略p109） （一）探针的制备 要求：长度一般以50~300bp为宜。 制备方法： (1) DNA重组技术 (2) PCR扩增 (3) 化学合成 四、核酸探针的制备方法 （二）核酸探针的标记方法（略p109） 1.核酸探针的放射性同位素标记 （1）缺口平移法 （2）末端标记法 （3）应用特异单引物法标记DNA探针 2.核酸探针的非放射性标记法 （1）核酸探针的生物素标记 （2） 核酸探针的地高辛标记 （3）核酸探针的光敏DNP标记 （4）核酸探针的三硝基苯磺酸（TNBS）标记 （5）核酸探针的辣根过氧化物酶标记 四、核酸探针的制备方法 理想的标记物（核酸探针）应满足： (1)标记前后探针基本结构、化学性质相同; (2)特异性强、本底低、重复性好； (3)操作简单、节时； (4)安全、无环境污染。 五、核酸探针的杂交方法 分子杂交：把亲源关系较近的，不同生物个体来源的变性DNA或RNA单链，经退火处理形成DNA-DNA或DNA-RNA这一过程叫分子杂交。 应 用： (1)检测特定生物有机体之间是否存在亲缘关系； (2)用来揭示核酸片段中某一特定基因的存在与否、拷贝数及表达丰度。 杂交的类型 （1）按杂交对象： DNA-DNA RNA-DNA （2）按作用环境： 固相杂交：是将参加反应的一条核酸链先固定在固体支持物上，一条反应核酸（标记探针）游离在溶液中。 液相杂交：所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中 （一）印迹杂交 基本过程： 第一，通过印迹技术将核酸片段转移到固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上； 第二，用标记探针与支持物上的核酸片段进行杂交； 第三，杂交信号的检测。 主要类型： 斑点印迹杂交(Dot-blot) Southern印迹(Southern blot) Northern印迹(Northern blot) 1. Southern印迹法 Southern印迹法(Southernblotting)是最早的DNA探针杂交技术，1975年，由英国分子生物学家E.M.Southern所发明。就是将凝胶上DNA片段转移到硝酸纤维素滤膜上后，在进行杂交。 被检测对象为DNA 　Southern印迹的操作方法有三种 ① 毛细管转移(或虹吸印迹) 进行毛细管转移时，DNA片段由液流携带从凝胶转移到固相支持物表面。 ② 电转移 利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上，可达到简单、迅速、高效的目的。 ③ 真空印迹法 利用真空作用将转膜缓冲液从凝胶上层的容器抽到下层，凝胶中的核酸片段将随缓冲液移置到凝胶下面的固相支持物上。 2.Northern 印迹法 Northern（Northern blotting）印迹杂交技术是1979年，J.C.Alwine发展出来的一种新方法 检测目的RNA的存在与否及含量。 是指将RNA片段变性及电泳分离后，转移到固相支持物上的过程 Northern印迹的方法与Southern印迹基本相同，可参照进行。 但RNA的变性方法与 DNA不同。DNA样品可先通过凝胶电泳进行分离，再用碱处理凝胶使DNA变性。而RNA不能用碱变性,因为碱会