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第七章 免疫技术检测食品微生物 第一节 免疫荧光抗体技术检测食品微生物 第二节 酶联免疫技术检测食品微生物 第三节 放射免疫分析测定技术检测食品微生物 第四节 单克隆抗体技术检测食品微生物 第五节 免疫金技术在食品微生物检测中的应用 第一节 免疫荧光抗体技术检测食品微生物 经典的免疫分析技术 　凝集反应、沉淀反应、溶血反应、补体结合实验 　特点：成本低、技术简单、结果易于判断，但不易于实现自动化。 现代的免疫分析技术 　荧光免疫标记、放射性免疫标记、酶免疫标记、镧系（稀土）元素免疫标记、临床化学免疫分析技术、发光免疫标记、流式免疫微球技术及生物传感器技术等。 　特点：灵敏、特异、快速、易于测定及实现自动化。 第一节 免疫荧光抗体技术检测食品微生物 一、免疫荧光抗体技术的定义及其发展 免疫荧光抗体技术（Fluorescent-labelled antibody technic）是指用荧光素对抗体或抗原进行标记，然后用荧光显微镜观察所标记的荧光以分析示踪相应的抗原或抗体的方法。 免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）包括荧光抗体技术和荧光抗原技术。 主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。 主要缺点是：非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂 发展： 第一节 免疫荧光抗体技术检测食品微生物 二、基本原理 抗体与荧光素结合后，并不影响其和相应抗原发生特异性结合反应，事先将待测抗原固定于载玻片上，滴加荧光标记抗体，若荧光标记抗体与相应抗原发生特异性结合反应，不能被缓冲液冲掉，在荧光显微镜下可观察到荧光，否则荧光抗体被缓冲液冲掉，在荧光显微镜下观察不到荧光。 第一节 免疫荧光抗体技术检测食品微生物 三、荧光抗体的制备 （一）荧光色素 4.荧光抗体的制备 第一节 免疫荧光抗体技术检测食品微生物 四、基本步骤 1.制片 可制作涂片、印片、细胞单层培养物、组织切片，经适当固定或不固定（微生物：涂片→干燥→固定→冲洗） 2.洗片 用PBS（pH值7.4）充分水洗标本 3.染色 切片经固定后，滴加相应荧光抗体，在室温或37℃染色30min，切片置入能保持潮湿的染色盒内，防止干燥。 4. 洗片 　倾去存留的荧光抗体，将切片浸入pH7.4或ph7.2PBS中洗两次，搅拌，每次5min，再用蒸馏水洗1min，除去盐结晶。 5. 封片 用50%缓冲（0.5mol/l碳酸盐缓冲液ph9.0～9.5）甘油封固、镜检 6．对照染色 7. 荧光显微镜观察 第一节 免疫荧光抗体技术检测食品微生物 五、免疫荧光抗体技术的类型 （1）直接法 优点：方法简便 特异性高 非特异性荧光染色少 缺点：敏感度偏低 检测每一种抗原需制备相应的荧光抗体 应用：病原微生物的快速检测 ；活检标本的免疫病理检查 第一节 免疫荧光抗体技术检测食品微生物 （2）间接法 优点：敏感度高于直接法 制备一种荧光抗体可用来检测多种抗原 既可用于检测抗原，也可检测抗体 缺点：易出现非特异性荧光；方法较麻烦； 操作时间较长 应用：自身抗体的检测 第一节 免疫荧光抗体技术检测食品微生物 （4）双重染色法 在同一标本上有两个抗原需要同时显示（如A抗原和B抗原），A抗原的抗体用FITC标记，B抗原的抗体用罗达明标记，可采用两种方法。 ①一步法双染色：先将两种标记抗体按适当比例混合（A+B），按直接法进行染色： ②二步法双染色：先用RB200标记的B抗体染色，不必洗去，再用FITC标记的A抗体染色，按间接法进行。 结果：A抗原阳性荧光呈现绿色，B抗原阳性呈现桔红色荧光。 第二节 酶免疫技术检测微生物 一、酶免疫技术的定义及其发展 （一）定义 酶免疫技术:用酶标记的抗原或抗体作为诊断试剂检测标本中相应的抗体或抗原。 特点： ⑴ 灵敏度高，可与放射免疫相比，检测能力可达ng水平。 ⑵ 应用范围广，既能检测抗体又能检测抗原，既能定性又能定量、定位及抗原分析 （二）发展 1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法 (enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA) 。ELISA现在已成为目前分析化学领域中的前沿课题 ，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术( immunoenzymatic techniques ) 的基础上发展起来的一