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细菌内毒素检查 2010.12 目录 1、实验原理 2、实验试剂 3、试验器具 4、检查方法概述 5、供试品溶液的制备 6、内毒素限值的确定 7、最大有效稀释倍数（MVD）的确定 8、鲎试剂灵敏度复核 9、干扰试验 10、供试品的细菌内毒素检查 实验原理 利用鲎试剂与微量内毒素产生凝集反应的现象，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。 阳性结果 实验试剂 鲎试剂 从海洋无脊椎动物“鲎”的蓝色血液中提取的变形细胞溶解物，经低温冷冻干燥精制而成的生物制剂。 鲎试剂的生物活性以其能检出细菌内毒素的最低有效浓度表示，即鲎试剂的灵敏度，单位为EU/ml。 实验试剂 细菌内毒素国家标准品 系自大肠埃希菌提取精制得到的内毒素，用于标定细菌内毒素工作标准品和标定，仲裁鲎试剂灵敏度。 试验器具 刻度吸管、凝集管（10×75mm）、三角瓶、小试管（16×100mm）、试管架、洗耳球、封口膜或金属试管帽、时钟、脱脂棉、吸水纸、剪刀砂轮。 耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30 分钟以上）去除，塑料用具应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械（目前多为无热原的一次性用品 ）。 检查方法概述 凝胶法 限量试验 半定量试验 光度测定法 浊度法（终点浊度法和动态浊度法） 显色基质法（终点显色法和动态显色法） 凝胶法：最简单、经济、应用最广泛，中国药典的“仲裁”方法 对干扰相对不敏感。 较光度测定法不灵敏 供试品溶液的制备 某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。 一般要求供试品溶液的pH 值在6.0～8.0 的范围内。 可使用酸、碱溶液或适宜的缓冲液调节pH 值。 内毒素限值的确定 一般按公式： L=K/M 式中 L 为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg 或EU/U（活性单位）表示。 K 为人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量。注射剂K=5EU/（kg·h），放射性药品注射剂K=2.5EU/（kg·h），鞘内用注射剂K=0.2EU/（kg·h）。 M 为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，依据药品使用说明书，《临床用药须知》确定。 例：某产品M为14.3mg/kg，L=5/14.3=0.35EU/mg 假如此产品的浓度为100mg/ml，那么， L=0.35?100=35EU/ml 最大有效稀释倍数的确定 最大有效稀释倍数（MVD） 指在试验中供试品溶液被允许稀释的最大倍数，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。 MVD=cL/λ 式中L 为供试品的细菌内毒素限值；c 为供试品溶液的浓度，当L 以EU/ml 表示时，则c 等于1.0ml/ml，当L以EU/mg 或EU/U 表示时，c 的单位需为mg/ml 或U/ml。如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD 取1，可计算供试品的最小有效稀释浓度c=λ/L；λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml）。 鲎试剂灵敏度复核 目的 考察鲎试剂的灵敏度是否准确、考察检验人员操作方法是否正确及实验条件是否符合规定。 当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。 鲎试剂灵敏度复核 2、按照标准品说明书，加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置漩涡混合器上混合15分钟。然后进行稀释，制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液，即 2λ、λ、0.5λ和0.25λ（λ为所复核的鲎试剂的标示灵敏度）四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30 秒钟。 鲎试剂灵敏度复核 细菌内毒素标准溶液的制备图示： 鲎试剂灵敏度复核 待复核鲎试剂的准备 取规格为0.1ml/支的鲎试剂18支，每支加入0.1ml检查用水使溶解备用（规格大于 0.1ml／支的鲎试剂，按其标示量加入细菌内毒素检查用水复溶后按0.1ml/管分装到凝聚管中，至少准备18管）。 鲎试剂灵敏度复核 鲎试剂灵敏度复核 计算 当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照为阴性时实验为有效，按下式计算反应终点浓度的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的复核结果。 λc=lg-1（ΣX/4） 式中 X 为反应终点浓度的对数值（lg）。 反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。 鲎试剂灵敏度复核 例子： 结果判断 当λc 在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）时，方可用于细