01抗原抗体反应实验精选.ppt

抗原抗体反应实验 抗原抗体反应antigen-antibody reaction 概念 基本原理 特点 影响因素 应用范围 一. 概 念 抗原和抗体的特异性结合反应 体内 产生保护效应 造成病理损伤 体外 多种表现形式:凝集,沉淀, 补体结合,中和等. 二. 基本原理 抗原和抗体分子结构及立体构型的互补 抗原-抗体结合力 疏水作用,氢键,范德华引力,静电吸引作用 4 types of noncovalent forces 三. 特 点 特异性和交叉反应 可逆性 一定条件下（低pH、高浓度盐、冻融等） → 抗原-抗体可被解离 最适比例 反应体系中抗原/抗体最适比例 →决定反应结果的关键因素 四. 影响因素 (一) 反应物自身因素 1. 抗体 * 来源 * 特异性与亲和力 * 浓度 2. 抗原 * 理化性质、表位多寡和种类 (二) 环境条件 1. 电解质 不可缺少 2. 酸碱度 pH 6-8 3. 温度 15-40?c 4. 时间 规定时间 五. 应用范围 用已知抗原检测未知抗体 用已知抗体检测未知抗原 大分子物质 药物、激素和炎性介质等各种半抗原物质 抗原抗体反应的基本类型 1. Precipitation--- 2. Agglutination--- 3. Radioimmunoassay 4. Enzyme-linked Immunosorbent Assay 5. Immunofluorescence 6. Western Blotting 7. Flow Cytometry and Fluorescence 8. Immunoelectron Microscopy 沉淀反应（Precipitation） 可溶性抗原＋抗体 沉淀 凝集反应（Agglutination） 颗粒性抗原＋抗体 凝集 本次实验涉及的抗原抗体反应 沉淀反应分类: Precipitation in fluids（液相沉淀） Precipitation in gels （琼脂扩散） - radial immunodiffusion （单相扩散） - double immunodiffusion （双相扩散） Gel Immunoelectrophoresis （ 凝胶免疫电泳） - rocket immunoelectrophoresis （火箭电泳） 免疫沉淀反应(precipitation) 原理 可溶性抗原+抗体 ?白色沉淀 内容 单向定量免疫电泳(火箭电泳) 琼脂糖双向免疫扩散 单向定量免疫电泳(火箭电泳) 实验原理： 将抗体混入琼脂内; 将待测样品（抗原）加入琼脂一端的加样孔中，进行电泳; 抗原在电泳时与抗体反应，比例合适时形成锥形沉淀峰（形如火箭）,峰高与抗原含量成正比; 以标准抗原的浓度为横坐标，峰高为纵坐标，绘制标准曲线，即可根据峰高从标准曲线中得出待测样品中的抗原含量。 * 实验流程 抗体+琼脂?琼脂板 ? 打孔数个(孔与板缘距离1cm) ? 加入样品(由低浓度到高浓度) ? 电泳 实验内容：抗原抗体反应 1. 火箭电泳 2. 琼脂糖双向扩散试验 3. 凝集试验(凝血试验) 实验步骤 1. 取熔化并冷却至50°c的1%琼脂糖凝胶，加入 anti-IgG抗体，混匀后浇至玻璃板上。 2. 凝固后，如下图打孔。 3. 第1-5孔加入10 ?l经倍比稀释的标准血清样品 1:32，1:16，1:8，1:4，1:2。第6孔加入待测血清。 4. 将琼脂板放入电泳槽，用滤纸与电泳槽搭桥连接， 样品孔一端接负极。电泳80v, 2-3h. （-） （+） 1：4 1：8 1：16 1：32 50ul 稀释液 50ul 1:2 血清 50ul 50ul 倍比稀释： 实验步骤 5. 取出琼脂板，在0.5%考马斯亮蓝中染