第六讲DNA芯片2015.pptx

DNA芯片技术复旦大学基础医学院潘銮凤 DNA 芯 片 发 展 历 史Southern Northern BlotDot BlotMacroarrayMicroarray/DNAchip12.5×12.5×0.94 mm, 25×76×0.94 mmDNA芯片是信息时代的产物，横跨生命科学物理学计算机科学微电子学化学材料科学 ? DNA 芯 片 技 术 的 原 理 在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量DNA片段以显微打印的方式有序地固化于支持物表面作为靶标（或称固相探针），待测的核酸片段人工标记上不同的荧光色素或同位素、生物素等作为探针（或称靶片段），一定条件下两者杂交，根据杂交后不同的信号，进行计算机分析，从而得到靶片段的基因序列、表达情况等信息。DNA chip(s); gene chip(s); cDNA chip; DNA array; oligonucleotide array; microarray; DNA芯片的特点 高度集成化 大通量平行分析 大规模 高灵敏度 样品需要量小 DNA芯片的主要类型原位合成芯片（光刻、喷印）预合成后直接点样芯片（接触式、非接触式）表达谱芯片基因组芯片测序芯片指纹图谱芯片诊断芯片毒理芯片等等DNA芯片是生物芯片（Biochip)的一种生物芯片按探针不同分为： 功能不同分为 样品制备芯片 生化反应芯片 检测芯片毛细管电泳芯片DNA芯片蛋白质芯片DNA芯片蛋白质芯片细胞芯片组织芯片多糖芯片神经元芯片等等第二节 DNA芯片技术的操作流程 DNA芯片技术操作流程图 芯片的制作 样品的制备和标记直接购买商品化芯片自行设计并向厂方定做购买芯片点样仪、玻璃片基或膜；购买/合成Oligo DNA或大规模PCR扩增目的片段；点样及固定；自制芯片待测样品核酸提取与纯化 标记 标记靶片段纯化反转录标记/PCR标记/随机引物标记等分子杂交图像采集和软件分析一. 芯片的制作准备 固相支持物（即芯片片基） 固定在芯片上的生物分子样品 制作芯片的仪器点阵设计（芯片上核酸探针序列的选择以及排布）1. 固相支持物的种类及预处理刚性支持物：玻片、硅片、瓷片膜性支持物：尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜膜结合玻片、FAST Slides 等原位合成法的支持物：衍生出羟基等活性基团直接点样法的支持物：包被氨基硅烷或多聚赖氨酸点阵的设计基本方阵标记空白点对照看家基因对照探针基因每种2或4点2. 芯片制备方法原位合成 适用于：寡核苷酸光导合成法（原位光刻合成法）10～40万/cm2压电打印法，密度低，产率高 预合成后直接点样 适用于：大片段DNA、寡核苷酸、mRNA 接触式点样（针式打印） 2500点/cm2 非接触式点样（喷墨打印） 400点/cm2 光导合成法（原位光刻合成） 美国Affymetrix公司专利 光敏保护基团；光蚀刻掩膜（或蔽光膜）光导合成法技术过程示意图 每一循环需进行四步反应，若合成含n（如8）个核苷酸的寡核苷酸，则需 4×n个化学步骤 (4×8＝32） 合成了 4n 个可能序列（48＝65536）合成速度快、步骤少、探针数目呈指数增长、阵列密度高；但光蚀刻掩膜昂贵、每步产率较低，因此合成探针长度较短30 nt 压电打印法 类似彩色喷墨打印，但有多个芯片喷 印头及储液囊，储液囊中装四种碱基 合成试剂，喷印头在整个芯片上移动 其化学原理：固相合成DNA 40～50nt，产率较高直接点样法(或称分配法)设计点阵人工合成的寡核苷酸片段； PCR、RT/PCR等扩增的DNA或cDNA片段； 基因组提取的DNA片段；表面带正电荷的芯片支持物阵列点样机(arrayer) 喷墨打印（非接触式）400点/cm2 针式打印（接触式）2500点/cm2紫外交联固定、Schiff碱连接法固定Cartesian - PixSys Series 二. 待检测样品的制备和标记 1. 待检测样品中mRNA或DNA的提取及纯化RNA的稳定性液氮或干冰; 立即抽提RNA 保护剂纯化2. RT、RT-PCR或PCR扩增靶片段 固相PCR系统3. 样品的标记伴随RT or PCR过程随机引物法、缺口平移法等标记物 荧光染料，如Cy3、Cy5 放射性核素，如 32P、33P 金属离子Au和Ag(纳米金属微粒探针) 酶（催化化学发光，荧光等） 生物素、地高辛的间接标记双/多色荧光标记标记产物纯化Cy3、Cy5双色荧光标记结果示意图探针标记方法反转录Eberwine法WT-ovation法TSA树状聚合物类型直接直接直接间接间接模板RNAdsDNA T7 RNA聚合酶dsDNA随机引物DNA聚合酶带标记的RNA或DNA含结合序列的RNA或DNA灵敏度低高高中中Eberwine法中的体外转录(in vitro tran