PCR常见问题分析及提高特异性的方法.ppt

PCR常见问题之一 无扩增产物 PCR常见问题之二 PCR常见问题之二 PCR常见问题之三 PCR常见问题之三 PCR常见问题之四 提高PCR反应特异性的四种策略 巢式PCR（Nest-PCR） 策略之一 巢式PCR（Nest-PCR） 策略之二 递减PCR（TouchDown PCR） 策略之三 热启动PCR （HotStart PCR） 策略之四 使用PCR增强剂 * * 模板:含有抑制物，含量低 Buffer对样品不合适 引物设计不当或者发生降解 反应条件：退火温度太高，延伸时间太短 原因 对 策 纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量 更换Buffer或调整浓度 重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物 降低退火温度、延长延伸时间 现象：正对照有条带，而样品则无； 非特异性扩增 现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。 引物特异性差 模板或引物浓度过高 酶量过多 Mg2+浓度偏高 退火温度偏低 循环次数过多 原因 对 策 重新设计引物或者使用巢式PCR 适当降低模板或引物浓度 适当减少酶量 降低镁离子浓度 适当提高退火温度或使用二阶段温度法 减少循环次数 非特异性扩增 拖尾 现象：产物在凝胶上呈Smear状态。 M