【2017年整理】8 超薄切片与半薄切片.doc

PAGE \* MERGEFORMAT PAGE \* MERGEFORMAT 5 第8讲 半薄/超薄切片技术 取材→固定→脱水→渗透→包埋→聚合→修块→切片→染色 背景： 肉眼 光学显微镜 透射电镜 分辨率 0.2mm 0.2μm 0.2nm 应用范围 可观察头发丝、双面刀刀刃的厚度 可观察细胞的结构(最大有效倍数:1000) 可观察细胞内的结构,分辨DNA、蛋白质等生物大分子、单个金属原子（放大倍数可达百万倍） 观察半薄切片 观察超薄切片 现有的透射电镜生物制品制备技术分为两类： 一类是透射电镜的基本制备技术，包括超薄切片和负染色法； 另一类是生物制品特殊技术，包括冷冻蚀刻法、冰冻割断术、电镜细胞化学术、免疫电镜术、电镜放射自显影技术、X线微区分析技术等。 基本概念 一、生物样品制备技术的重要性 1、决定电镜图像分辨率的两个因素 1）电镜本身的分辨本领 2）样品的结构和反差，而样品的结构与反差在很大程度取决于样品制备技术 2、电镜样品应具备的基本条件 1）样品必须彻底干燥； 2）样品要进行提高反差处理 2）样品要进行提高反差处理 4）样品耐受电子束的轰击 5）充分保存好生物样品的超微结构 二、TEM样品制备技术分类 1、超薄切片技术（普通） 2、冷冻超薄切片技术 3、冷冻置换和低温包埋技术 4、金属投影技术 5、表面复型技术 6、冷冻(断裂)蚀刻及复型技术 7、免疫电镜技术 8、电镜细胞化学技术 7、8、9是TEM，SEM共有 9、电镜放射自显影技术 三、超薄切片技术概述 1、超薄切片 ★样品厚度在10～100nm之间的切片，超薄切片TEM专用 石蜡切片h=10mm(5~50mm) 2、制作超薄切片的必要性 1) 增加电子透射能力 2) 电镜的场深大，切片太厚，上下结构重 叠,使得图像不清楚 3) 减少色差 4) 减少样品对电子的吸收 3、对超薄切片的要求 ⑴ 细胞的细微结构保存良好，没有明显的物质凝聚、丢失、添加等人工效应 ⑵ 切片厚度500～700?为宜 ,小于1000 ? 太薄：?高，反差低 太厚：?低，反差好，结构重叠，电子甚至 不能穿透 ⑶ 切片应耐电子束的强烈照射，不变形，升华 ⑷ 切片能够适当被染色，保证一定的反差 ⑸ 切片均匀，无皱褶、刀痕，无染色剂或其他 化学物质的沉淀 普通超薄切片技术： 取材 二、固定 三、脱水 四、渗透与包埋 五、超薄切片 六、电子染色 一、取材 1、含义：指从生物体上取下要观察的组织块。 注意：由于水解酶的作用可引起细胞自溶 2、取材操作规则:快,小, 冷,准,稳,轻(防损伤) ⑴ 快：动作迅速,快取,投入固定液 ⑵ 小：样品体积小,动1mm3,植宽1，长3～4mm ⑶ 冷：0～4℃ ⑷ 准：取的部位准，有代表性、目的性 ⑸ 轻：操作轻巧，避免拉、锯、压 A、按样品类别分为： ⑴动物材料 麻醉→解剖→ 戊二醛预固定（ 0～4℃， 2％～5％） 在预冷的玻板上细切（1mm3） →戊二醛前固定 (1～3h) →漂洗（10～30min） → 1％锇酸后固定 (1～2h) ⑵植物材料 叶片宽1，长3～4，有时需脱蜡 根茎果实1mm3 ⑶单细胞：洗去有机成分→固定→预包埋→切块 B、按取材地点分为： ⑴野外取材：冰壶 ⑵实验室室内取材 1.2 取材方法 材料放在洁净的韧性较大的纸上→滴上预冷的固定液→用刀片将组织切下并修小 →用牙签或镊子将组织块移至盛有预冷的固定液的小瓶中。 植物材料的取材可以先切成薄片，经适当固定后再切成小方块继续固定。 二、固定 （一）固定的基本知识 1、概念：用化学或物理方法迅速将细胞、组织杀死,同时把从细胞间的联系到细胞器的分子结构等全部组织的活体形态、精细结构及其组成真实的保存下来. 2、常用的固定方法 化学方法：锇酸（OsO4), 戊二醛 （C5H8O2),甲醛(HCHO)，高锰酸钾KMnO4、 重铬酸钾、丙烯醛 物理方法：冷冻，干燥，高温 3、固定的目的 ⑴ 把细胞中的动态系统定格，要求生命过程立即停止,细胞和它周围组织中的半液体内含物立即凝固而不分解,接近细胞有机体的生活状态 ⑵ 防止以后的制备过程中丢失或添加成分 ⑶ 使其在电镜下有良好的电子反差 4、固定的标准 细胞内膜结构线条清晰连续不断，细胞基质无明显溶泡和颗粒凝集 固定液的作用： 1）组成： 固定液：固定剂＋缓冲液 2）作用： ⑴ 破坏细胞的酶活性系统 ⑵ 稳定细胞物质成分，并保存之 ⑶ 接近细胞生活状态的渗透压,使细胞不收缩或膨胀 ⑷ 在组分的分子之间建立交联，提供骨架稳定细胞器的空间构型 ⑸ 提供一定的电子反差 （二）常用的固定剂 1、常用、理想固定剂应