6第6讲基因工程48.ppt

一.基因工程概念;二、基因工程中常见的工具酶;限制性内切酶;限制性内切酶作用过程;DNA连接酶;DNA连接酶的作用过程;基因工程载体;基因工程中常用的载体;质粒的特点;三、基因操作的基本步骤;典型基因工程过程示意图;1、提取目的基因;将总DNA提取分离，然后用限制性内切酶将总DNA切开成为许多小的片段，将这些基因组片段分别克隆在载体上，便构成该生物的基因文库。一般用与目的基因部分序列互补并标记了放射性同位素的一小段单链DNA 作为探针对克隆的基因文库进行杂交，互补结合需要的基因片段，根据放射性同位素在胶片上感光的原理，可以找到目的基因。这个办法通常称为印迹法。工作量很大;印 迹 法;印迹法的主要步骤：（1）基因文库－ DNA 用限制性内切酶处理。 （2）DNA 片断混合物通过电泳分离。（3）电泳后，通过印迹技术转到酯酰纤维薄膜上，以便操作。 （4）用已知小片断DNA 作为探针，互补结合需要找的基因片断。（5）探针DNA 片断已用放射性元素标记，使胶片感光后可看出。; 印迹法的关键是“分子杂交”，利用碱基配对的原则，用一段小的已知的 DNA 片断去寻找大的未知的基因片断。探针 DNA 片断从何而来？ 根据目的蛋白的氨基酸序列，只要其中 N端 15－20 个氨基酸序列，按三联密码转为 40-60 核苷酸序列，人工合成，即为探针 DNA 片断。;（2）逆转录合成法 （如果所需要的DNA片段很小） 以RNA为模版，逆转录合成互补的DNA片段。 先将细胞核内的基因组转录为RNA，以信使RNA（mRNA）为模板，在逆转录酶的作用下根据碱基互补原则人工合成一段与之互补的DNA片段，再以此单链DNA为模版，人工合成另外一条互补的DNA子链，从而获得所需的目的基因。 mRNA→单链DNA→ 双链DNA（cDNA） ;（3）聚合酶链式反应（PCR） （如目的基因的核酸顺序已知） 聚合酶链式反应（PCR）是近年来开发出来的基因工程新技术，它的最大优点是把目的基因的寻找和扩增，放在一个步骤里完成。 反应在特制的PCR仪中进行，需要DNA模版、引物、TaqDNA聚合酶、四种脱氧核苷酸。 ;基因克隆是指通过重组基因操作，把目的基因连接到载体上，在宿主细胞中增值，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。 克隆——生物分子，细胞,生物个体的无性繁殖与复制过程都称为克隆。;2、构造重组DNA分子 ;目的基因与质粒的连接;3、将目的基因导入受体细胞并扩增;4、目的基因的检测; （2）Southern杂交 对于外源目的基因在转基因生物中的情况检测好可采用放射性同位素标记的核酸杂交法进行检测，也称为该法是利用毛细管作用使在凝胶电泳中分离的DNA片段转移并结合在合适的滤膜上，然后通过与已用同位素标记的单链DNA探针的杂交作用以检测这些被转移的DNA片段。 ;（3）核苷酸测序法（自动检测分析）。 已知目的基因的核苷酸序列可利用序列测定进行鉴定。 该方法是一种使用荧光染料的无放射性标记的DNA测序法。它使用4种不同颜色的荧光染料分别标记4种不同的碱基，并在一个凝胶电泳的泳道中进行电泳，然后通过激光作用诱发荧光，达到检测碱基的目的。激光检测器招收集到的信息传到电脑，计算机会自动显示或打印出碱基顺序。一块凝胶36个泳道可测36×450约16200个碱基。后来又发明了一种用毛细管电泳代替凝胶电泳的方法，可大大加快电泳的速度分辨率，并可实现自动灌胶和自动进样。 ;四、基因工程的应用;重组人胰岛素 1982年世界第1个转基因产品 1000 磅牛胰 10 克胰岛素 200 升发酵液 10 克胰岛素 将与产人胰岛素有关的两个基因片段（人工合成的）转入大肠杆菌;（2）生产生物小分子 生产维生素C替代合成法。 提高氨基酸产量（将某些基因转入高产菌中）（3）生产生物多聚体 生产黄原胶、生物合成橡胶、生产生物可降解塑料;（4）在生物农药上的应用 通过基因改造大规模生产微生物杀虫剂、生物除草剂。（5）在环境工程中应用 美国 GE 公司构造成功具有巨大烃类分解能力的基因工程菌，并获专利，用于清除石油污染。;（6）转基因植物 抗病虫基因、抗除草剂基因、抗旱基因、抗病基因、抗寒基因、某些动物蛋白基因。目前世界上大规模种植的转基因作物有：水稻、大豆、马铃薯、玉米、番茄、烟草、棉花、油菜、甜菜、向日葵、豌豆、辣椒、苜蓿、苹果、梨、兰花、玫瑰、康乃馨在植物转基因中多采用农杆菌作为目的基因受体，再利用重组农杆菌感染植物细胞进行转化，将目的基因整合到植物基因中。;（7）转基因动物转基因动物主要用于生产器官移植的研究，生产对人