PCR技术和注意事项.ppt

;PCR:聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术。 1971 Khorana 等最早提出核酸体外扩增的设想； 1983年Mullis发明并申请专利。 ;根据DNA的半保留复制。;缓冲液 4种dNTP混合物（终浓度） 引物（终浓度） 模板DNA Taq DNA聚合酶 （耐热DNA聚合酶--Taq酶的发现对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本。） Mg2+（终浓度） 双蒸水 ;变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成。 ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； ②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。 重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。;RT-PCR ：首先提起RNA，然后用逆转录酶与mRNA为模板进行cDNA第一链的合成，然后的原理和PCR就一样了！RT-PCR是个半定量的实验，可以确定在mRNA水平的表达差异。 免疫PCR(immuno polymerase chain reaction , IPCR ）原理：是用一段已知DNA 分子标记抗体作为探针,用此探针与待测抗原反应,PCR 扩增粘附在抗原抗体复合物上的这段DNA 分子,电泳定性,根据特异性PCR 产物的有无,来判断待测抗原是否存在。 ? 巢式PCR：是用内外两对引物扩增拷贝数较低的片段。先用外引物进行第一轮反应,将产物适当的稀释,然后用内引物继续扩增. 比较适合微量DNA或者石蜡组织抽提的DNA?。 ;原位PCR技术：原位PCR就是在组织细胞里进行PCR反应，它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异??感的PCR技术的优点，是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜力的新技术.。 实时荧光PCR：利用荧光来检测PCR产物，PCR每循环一次就收集一个数据，通过实时扩增曲线，准确确定CT值，从而确定DNA拷贝数?。 除此之外，还有锚定PCR、反向PCR、不对称PCR、长距离PCR、降落伞PCR、梯度PCR等30几种PCR。;模板：避免污染，提高质量，浓度适宜（ 25-100ng）。 浓度过高增加非特异性； 浓度过低会降低扩增效率，使PCR产物量少。 ;引物：设计得当，特异性高。 长度：15-30bp 碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3‘端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。　　 引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。　　 引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。尤其避免错配！ 引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。 必要时，引物上可以加入合适的酶切位点，有利于分子克隆。;dNTP：多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，浓度过低会降低PCR产物的产量。 尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。 ;Taq酶：扩增产物随酶用量的增加，呈增多的趋势。浓度在10-15U效果较好。若太高，则降低扩增的特异性；若太低，则会影响PCR扩增反应。 ;Mg2+ ：作用是1.促进polymerase的活性；2.核苷酸进入聚合酶的