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PCR技术和注意事项.ppt 32页

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;PCR:聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术。1971Khorana等最早提出核酸体外扩增的设想;1983年Mullis发明并申请专利。;根据DNA的半保留复制。;缓冲液4种dNTP混合物(终浓度)引物(终浓度)模板DNATaqDNA聚合酶(耐热DNA聚合酶--Taq酶的发现对于PCR的应用有里程碑的意义,该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活,不需要每个循环加酶,使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本。)Mg2+(终浓度)双蒸水;变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成。①模板DNA的变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;③引物的延伸:DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶(如TaqDNA聚合酶)的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基互补配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。;RT-PCR:首先提起RNA,然后用逆转录酶与mRNA为模板进行cDNA第一链的合成,然后的原理和PCR就一样了!RT-PCR是个半定量的实验,可以确定在mRNA水平的表达差异。免疫PCR(immunopolymerasechainreaction,IPCR)原理:是用一段已知DNA分子标记抗体作为探针,用此探针与待测抗原反应,PCR扩增粘附在抗原抗体复合物上的这段DNA分子,电泳定性,根据特异性PCR产物的有无,来判断待测抗原是否存在。?巢式PCR:是用内外两对引物扩增拷贝数较低的片段。先用外引物进行第一轮反应,将产物适当的稀释,然后用内引物继续扩增.比较适合微量DNA或者石蜡组织抽提的DNA?。;原位PCR技术:原位PCR就是在组织细胞里进行PCR反应,它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异??感的PCR技术的优点,是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜力的新技术.。实时荧光PCR:利用荧光来检测PCR产物,PCR每循环一次就收集一个数据,通过实时扩增曲线,准确确定CT值,从而确定DNA拷贝数?。除此之外,还有锚定PCR、反向PCR、不对称PCR、长距离PCR、降落伞PCR、梯度PCR等30几种PCR。;模板:避免污染,提高质量,浓度适宜(25-100ng)。浓度过高增加非特异性;浓度过低会降低扩增效率,使PCR产物量少。;引物:设计得当,特异性高。长度:15-30bp碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3‘端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。   引物3’端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。   引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。尤其避免错配!引物量:每条引物的浓度0.1~1umol或10~100pmol,以最低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会。必要时,引物上可以加入合适的酶切位点,有利于分子克隆。;dNTP:多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中,dNTP应为50~200umol/L,浓度过低会降低PCR产物的产量。尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制),如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低),就会引起错配。;Taq酶:扩增产物随酶用量的增加,呈增多的趋势。浓度在10-15U效果较好。若太高,则降低扩增的特异性;若太低,则会影响PCR扩增反应。;Mg2+:作用是1.促进polymerase的活性;2.核苷酸进入聚合酶的活性中心也需要镁离子来消除dna骨架上磷酸基团的负电荷。浓度过高可降低PCR扩增的特异性,浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。;温度:变性温度:达不到变性温度就不会产生单链DNA模板,PCR也就不会启动。变性温度低则变性不完全,DNA双链会很快复性,因而减少产量。一般取90~95℃。样品一旦到达此温度宜迅速冷却到退火温度。DNA变性只需要几秒种,时间过久没有必要;反之,在高温时间应尽量缩短,以保持TaqD

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