把目的基因克隆到入门载体（EntryVector）后,就不用依.docx

? Gateway也可以被视为一种克隆操作平台：把目的基因克隆到入门载体（Entry Vector）后，就不用依赖限制性内切酶，而靠载体上存在的特定重组位点和重组酶，高效、快速地将目的基因克隆到其它的受体载体（Destination Vector，目的载体）上。???? Gateway的原理也是建立在噬菌体DNA定点整合到细菌宿主基因组上。在噬菌体和细菌的整合因子（INF、Int）的作用下，lambda的attP位点和大肠杆菌基因组的attB位点可以发生定点重组，lambda噬菌体DNA整合到大肠杆菌的基因组DNA中，两侧产生两个新位点：attL和attR。这是一个可逆的过程，如果在一个噬菌体编码蛋白Xis和IHF、Int的共同介导下这两个新位点可以再次重组回复为attB和attP位点，噬菌体从细菌基因组上裂解下来。这一过程的方向是受控于两个重要因素：存在的介导蛋白和重组位点。??? 在Gateway系统中,入门载体包含两个重组位点序列attL1和attL2，大小均为100bp，中间夹着一个自杀基因——ccdB基因。由于ccdB基因的表达产物能抑制普通的E.coli生长，在克隆时没有切开或者自身环化的载体在转化时不能生长。在构建含目的基因的入门载体时必须切掉这个基因，接入目的基因。ccdB基因两端可以选择的酶切位点有限（2个），同时还必须考虑读码框架、启动子、终止密码等问题，因此Gateway系统提供了5种不同的入门载体以供选择。需要特别注意的是转化用的菌株必须是不含F附加体的，因为它表达的一种产物能阻断ccdB基因，影响筛选结果。 ??? 同样，目的载体（Destination Vector）也必须和Gateway系统配套，即目的载体的表达调控元件下游有两个重组位点attR1和attR2，大小均为125bp，同样也夹着一个ccdB自杀基因。??? 当需要将目的基因从入门载体（Entry Vector）转移到目的载体（Destination Vector）时，只要将两种质粒混合（线性化能有效提高重组率），加入含有Int、IHF、Xis等重组因子的LR重组酶混合物，attR2序列和attL2序列发生重组，生成一个融合质粒。attL1序列再和attR1序列重组，融合质粒分解为两个新的质粒，目的基因与原来位于目的载体上的自杀基因发生重组置换，得到一个带目的基因的目的载体（生成新的重组位点attB1、B2）和带自杀基因的入门载体（生成新的重组位点attP1、P2）。反应过程需要25度保温1小时（时间越长，重组率越高，特别是较大的质粒，反应过夜能提高5倍重组效率），蛋白酶K37度处理10分钟，转化。由于带自杀基因的载体不能生长，加上抗生素筛选，转化产物重组率高达90%以上。同样，转化用的菌株必须是不含F附加体的。????? 由于在这个反应中attL1序列只和attR1序列重组，attL2序列只能与attR2序列重组，这个方向的反应称为LR反应。LR反应生成新的位点称为attP1/2（200bp）和attB1/2（25bp）序列。 在一定的条件下，attP和attB序列也能发生重组，生成attL和attR序列，这个反向反应称为BP反应。????? 当用户得到一个含目的基因的Gateway表达载体，希望将目的基因转移到另外几个Gateway表达载体中时，只要先将目的基因从Gateway表达载体中转移到入门载体上，在由入门载体转移到其它的表达载体就行。将含目的基因的Gateway表达载体（attB1—目的基因—attB2序列）与带有attP1-ccdB(自杀基因)-attP2序列的供体载体（pDONR，注意这个载体不同于入门载体Entry Vector）混合，加入含有Int、IHF的BP重组酶混合物，25度保温1小时，37度蛋白酶K处理10分钟，根据与上面相同的原理，attP和attB序列也能发生重组，生成带有目的基因的入门载体（Entry Vector）和带自杀基因的表达载体。同样，由于抗性不同以及自杀基因的作用，只有含目的基因的入门载体能被筛选出来。这即是BP反应。需要特别注意的是表达载体如果也是卡那霉素抗性，就必须选择另外一个供体质粒以便筛选。??? 使用Gateway系统的第一步即为入门载体的构建，有以下几种方法：??? A PCR重组克隆???? 以下列方式合成PCR引物，即GGGG-attB1或者attB2序列（25bp）-基因特异性序列（18到25个碱基或以上），这样在PCR扩增目的基因时就可以直接得到两端带有attB1/2基因的片断。将PCR产物直接与上述的供体载体（带有attP1-ccdB(自杀基因)-attP2序列）混合，加入BP重组混合酶，25度保温1小时，再37度蛋白酶K处理10分钟，即可转化并得到带有目的基因的入门载