红曲代谢产物Monascin的制备及其抗肿瘤作用研究.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 红曲代谢产物Monascin的制备及其抗肿瘤作用研究 * 课题背景及立论依据 红曲霉菌—我省最具特色的微生物资源，经固、液态发酵产红曲 红曲—可用于酿酒、制醋，可作为食品染色剂和调味剂，含有多种活性代谢产物，作为中药 红曲产品主要有发酵用红曲、功能性红曲和色素添加剂，其中色素红曲、红曲红和红曲黄色素等占红曲产业链总产值的80%以上 红曲霉菌主要代谢产物—红曲色素、Monacolin 类化合物、γ-氨基丁酸、桔霉素等 * 课题背景及立论依据 ——红曲色素 红曲霉菌次级代谢产物 混合色素,醇溶性红曲色素6种，水溶性4种 醇溶性色素主要分为红、橙、黄色素3类，每类色素各含两种色素单体 * 课题背景及立论依据——红曲色素生理活性 抗菌、降胆固醇、抗阿尔兹海默症、抗癌 Ankaflavin（Y2）对人肝癌细胞Hep G2具有细胞毒性，IC50值约为15 μg/ml，而在同样浓度下，对正常细胞系MRC-5和WI-38却几乎没有细胞毒性。形态学变化研究和流式细胞术检测周期分布，发现有染色体皱缩及碎片，并有明显的G1亚峰 口服Monascin （Y1）可以抑制过氧化亚硝酸盐或紫外线诱导的皮肤癌 Rubropunctatin （O1）对人神经瘤细胞SH-SY5Y、人胃癌细胞BGC-823、AGS和MNK45均具有显著的增殖抑制作用，而对人正常胃粘膜上皮细胞GES-1则无细胞毒作用 高纯度红曲色素具有成为新型抗癌药物的潜力 * 课题背景及立论依据——细胞凋亡与细胞分化 细胞凋亡——程序性细胞死亡，主要有线粒体路径和死亡受体路径 诱导分化——恶性肿瘤细胞在体外分化诱导剂的作用下，向正常细胞方向分化逆转的现象。 典型事例：全反式维甲酸（ATRA）治疗急性早幼粒细胞白血病 研究热点——从天然资源（包括动植物、微生物等）中分离得到高纯度的组分，并评价其抗癌活性和探索作用机理 * 实验路线 高纯度红曲色素单体的制备 红、橙、黄3组红曲色素抗肿瘤作用初筛(MTT实验) 红曲色素单体对肿瘤细胞生长抑制作用机制探索 对人胃癌细胞AGS生长抑制作用机理探索 对人恶性黑色素瘤细胞A375生长抑制作用机理探索 * 1 高纯度红曲色素提取分离 乙醇萃取-高速逆流色谱法分离-结晶组合技术 水提 30%醇提 70%醇提 70%醇提——红（Red-1和Red-2）、橙（Orange-1和Orange-2）、黄（Yellow-1和Yellow-2）色素为主要成分的提取液 1.1 提取 图1-1 HPLC-PAD检测醇溶性红曲色素组分 * 1 高纯度红曲色素提取分离 筛选出正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水溶剂系统，制定了两步分离策略，实现了6种组分的分离纯化，纯度高于90.0% 1.2 高速逆流色谱法 n-hexane–ethyl acetate –methanol–water (10:0:7.5:2.5, v/v/v/v) n-hexane–ethyl acetate –methanol–water (2.5:7.5:5:5, v/v/v/v) 图1-2 高速逆流萃取法分离醇溶性红曲色素 * 1 高纯度红曲色素提取分离 采用热饱和溶液法，获得块状（红）、针状（橙）、片状（黄）晶体，纯度大于98.5% 1.3 结晶法 图1-3 6种红曲色素样品的检测 * 2 红曲色素对不同肿瘤细胞生长的影响 A375 A431 PC-3 AGS 2.1 MTT初筛（红、橙、黄3组色素，24、48h） * 2 红曲色素对不同肿瘤细胞生长的影响 红曲色素对4种细胞系的IC50（μmol/L） groups Time （h） Cell lines 恶性黑色素瘤A375 表皮鳞癌细胞A431 前列腺癌细胞PC-3 胃癌细胞AGS 红（R1+R2） 24 181.6 251.5 147.3 121.3 48 128.26 170.8 131.1 44.8 橙（O1+O2） 24 1051.5 806.9 985.4 723.3 48 2705.7 332.2 704.0 198.3 黄（Y1+Y2） 24 138.46 146.6 108.9 27.3 48 68.1 148.6 74.8 19.5 Taxol 24 17.1 — — 15.6 48 8.9 — — 4.0 2.1 MTT初筛 * 2 红曲色素对不同肿瘤细胞生长的影响 结论：Monascin对正常组织细胞的抑制作用不及紫杉醇，其毒副作用较小，具有一定的安全性。 图2-1 Monascin和紫杉醇对胃粘膜上皮细胞GES-1细胞