细胞工程第六章胚胎工程.ppt

第六章 胚胎工程 曹君迈 6.1胚胎工程 胚胎工程（embryo engineering） 是指所有对配子和胚胎进行人为地干预，使其环境因素、发育模式或局部组织功能，发生量和质的变化的综合技术。 胚胎工程的历史：1891年，英国剑桥大学的希普就在兔子身上首次成功地进行了受精卵的移植实验。20世纪30年代，一些学者相继在鼠、兔、绵羊、山羊、猪、牛和马等动物进行胚胎移植试验，获得成功。 胚胎工程的意义： (一)发挥优良母畜的繁殖潜力 (二)促进家畜改良的速度 (三)作为胚胎操作的基础 (四)保存遗传资源 6.2胚胎工程的技术方法 6.21人工受精 6.22胚胎移植 6.23胚胎分割 6.24胚胎融合 6.25动物性别与胚胎性别鉴定 6.26胚胎冷冻保存技术 6.21人工受精 1.精子 2.卵母细胞 3.体外受精 1精子 1)精子的获得： 精液的采取方法通常有：人工阴道法、电刺激法、阴道内回收法等。 对于个体较大的动物多采用人工阴道法，而对于小动物而言多采用电刺激法采精。 2）精子的成熟和获能 精子离开精巢后，无使卵受精的能力，它必须经过在附睾中成熟及在雌性生殖道内获能，才具有使卵受精的能力。 在附睾液和精液中存在着附睾蛋白和精清蛋白，称为去获能因子，精液中的精子表面被覆了这种因子。在雌性生殖道中的分泌物可以去掉这些覆盖物而使精子质膜、顶体发生一系列变化。 人为使得精子获能 可以利用自然交配法，即在交配后，由雌性生殖道回收精子。 而雌性生殖道获能没有种属特异性，因而可以由屠宰场取任何的动物的子宫或在实验室内取小动物的子宫给所需动物的精子获能。 另外，可以利用人工配制的培养液使得精子获能。 3)精液的保存 精液的保存可以分为常温（15－25℃）、低温（0－5℃）和超低温冷冻（－79℃－-196℃）三种，其目的是要降低精子的代谢活动，延长其存活时间，尽量保存其受精能力。 保存前，要加稀释液，其成分按其作用可分为稀释剂、营养剂和保护剂等。 稀释剂包括等渗氯化钠溶液和某些盐溶液， 营养剂包括糖类、奶类和卵黄等， 保护剂包括有抗冻作用的营养剂和其它一些如甘油、DMSO、糖类等。 三种保存方法 常温保存主要通过降低pH值达到抑制精子的代谢活动，一般可以保存2天以上。 低温保存主要是抑制其正常的代谢活动，除猪外，其它家畜的保存效果均较好。 如果应用超低温可以在液氮中长期保存精液，用时可以即时解冻。 对于不同的动物，各种保存液的配制方法都有所差异的。 2采卵 1)输卵管内采卵：以鼠为例，一般为了防止干燥可将屠杀后取出的输卵管放在平皿内，用石蜡油覆盖，在实体显微镜下找到输卵管膨大不，用磨尖的钟表镊子，切开输卵管膨大部，使内容物溢出而找到卵。 2)对于稍大一些的动物可以用活体输卵管采卵，例如将兔子的腹部正中线切开，找出子宫角和输卵管。然后利用逆向冲卵法，自子宫输卵管连接处插入注射针，伞部以平皿接着冲洗；或在子宫输卵管连接处下1cm处，剪成V形小口，插入塑料细管，自伞部输卵管腹腔口插入，将液体推入，得到冲出的卵。 2采卵 3) 对于屠宰场中的大中型动物，可以用注射器插入卵泡中抽取，或在手术后暴露卵巢，以注射器自卵泡中取卵。 4) 对人而言通常在超数排卵步骤处理后，用B超检测卵巢表面卵泡发育情况，然后，在腹腔后部体壁进行局部麻醉，将腹腔镜望远镜插管插入，以观察卵巢表面卵泡成熟情况，然后用套有聚四氟乙烯套管的吸卵针将卵吸出，放平皿中检查。 3体外受精 体外受精（in vitro fertilization，IVF）就是将哺乳动物卵母细胞从母体取出，在体外进行精卵结合的过程。 主要包括：成熟或未成熟的卵母细胞获得、体外培养系统的建立、处理附睾内和射出精子、使精卵结合——受精、受精卵的体内或体外培养（in vitro culture，IVC）、移植妊娠和产仔 由于体外受精在实验室进行，所以得到的动物或人称为“试管动物”或“试管婴儿”。 历史 1951年Chang和Austin发现了精子的获能现象，为体外受精的实现打开了通路。 1954年，Thibault等获得第一只体外受精的兔子。随着研究深入，试管老鼠、试管猪、试管牛等相继产生。 1978年，Steptoe和Edwards制成了世界上的一例“试管婴儿”，至此，体外受精技术逐渐成熟。 过程 显微操作协助受精 在显微操作仪下进行显微受精，即对哺乳动物的精子和卵母细胞，进行显微操作，促使其相互结合技术，这可以解除透明带和质膜对精子的阻挡作用。 1976年，Uehara和Yanagimachi将仓鼠或人的精子在显微操作仪下，通过显微工具，注射到仓鼠卵母细胞的细胞质中，使精子核在卵胞质中染色体解螺旋形成了原核。随后，又深入研究了操作技术，分成了卵胞质内精子注射、透明带下注