第二章动物组织和细胞培养.ppt

　　1 在实验室中所有感染性材料的操作都必须在Ⅲ级生物安全柜中进行。如果工作人员穿着整体的由生命维持系统供气的正压工作服，则相关操作可在Ⅱ级生物安全柜中进行。 　　2 所有工作人员进入实验室时都必须换上全套实验室服装，包括内衣、内裤、衬衣或连衫裤、鞋和手套等。所有这些实验室保护服在淋浴和离开实验室前均必须在更衣室内脱下。 (六) 培养细胞生长的条件 1 细胞的营养需要 2 细胞的生存环境 温度: 37 ℃，O2 CO2: 5%，CO2 +H2O ← →H2CO3 ← →H+ + HCO3- pH: 7.2-7.4 3 无污染 4 无毒 1 细胞培养用液的配制 1）水：新鲜配置的三蒸水或去离子水 2）平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液，维持一定渗透压和pH PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 ml 3）消化液： 胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。 胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制,常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％ 。用滤器过滤除菌。 胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。 4）培养基： 培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。 ①天然培养基： 天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。 优点：营养成分丰富，培养效果好 缺点：来源受限 成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。 易发生支原体污染 ②合成培养基： 　　　　合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。 　　　　合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。 　　　 　　　　优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低 。 　　　　缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。 　　　　人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。 　　　　血清中含有： 　　　　①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等） ； 　　　　②多种金属离子； 　　　　③激素； 　　　　④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等； 　　　　⑤各种生长因子； 　　　　⑥转移蛋白； 　　　　⑦不明成分。 一般说来，含5％小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死，但支持细胞生长一般需加10％血清． 血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子， 因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。 ③无血清培养基:在基础培养基中补充各种必需因子，如激素、生长因子 、结合蛋白 、贴壁和扩展因子 等。 无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。 无血清细胞培养基优点保证了实验结果的准确性、可重复性和稳定性，减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序。 血清质量好坏是实验成败的关键。 常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。 优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。 血清的灭活（消除补体活性）：56 ℃ ，30 分钟 血清的消毒：过滤除菌 补体是热敏性的，是机体免疫防御系统的重要组成部分，其主要功能是抗感染，补体虽然具备杀死病菌的作用，但有时也伤害好细胞，引起炎症的作用。 抗菌素的使用： 在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。 通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。 庆大霉素：每毫升100单位——方便、广谱、稳定。 基础培养基 80％一95％ 血清 5％一20％ 碳酸氢钠 2.0 g/L 青、链霉素 各100单位／毫升 ④完全培