荧光PCR系列产品操作培训.ppt

样本保存 样本采集后，如若不能马上检测，应将样本置于冰箱4℃存放，并在一周时间内检测。应避免反复冻融。 一周后检测的标本应保存在-20 ℃。 棉拭子样本应在真空管中保存，要操作前再加生理盐水/细胞保存液进行洗脱。 DNA提取 取800ul样本离心得沉淀 ↓ 加入细胞裂解液50ul，煮沸10min ↓ 12000离心10min即可上机 若肉眼未见沉淀，可增加取样量，再次离心收集沉淀； 若沉淀杂质较多，可用细胞保存液洗涤1-2次； 血液多样本，用蒸馏水洗涤1-2次； 粘液多样本，取样时尽量去除粘液。 应注意防止爆盖： 金属浴可压重物（冰盒、冰袋等） 水浴应采用螺旋管盖的离心管 确保离心管质量合格 优点：简单、快捷、方便。 缺点：HPV DNA纯度较差，含有血红素、蛋白、脂类等PCR抑制剂。 针对泌尿生殖道样本（棉拭子样本），先用细胞保存液/生理盐水洗脱，收集沉淀，而后与上述操作一致 PCR试剂配制 PCR MIX（μl） Taq 酶（μl） DNA 模板（μl） 1人份量 17.5 0.5 2/人份 10人份量 175 5 2/人份 按样本数加入所需溶液的对应量，充分混匀再分装 对照设置 定性试验 每次试验都必须设置阴阳性对照 定量试验 个别医院要求定量结果，需增加标准品（105、106、107、108 copies） 标准品一般可以反复冻融3-4次，超过5次，则不建议使用 标准品置于-20℃中保存 操作注意事项 PCR试剂保存配制 PCR试剂应放于-20℃避光保存 PCR试剂应避免反复冻融 试剂配制时不能佩戴有粉手套 PCR mix与Taq酶充分混匀 加模板时应避免吸到沉淀 漂浮的杂质常粘附于管壁，中间吸样较安全 切勿在PCR管上做标记，但应注意样本顺序 上机前应离心去除气泡 标准品加样时应尽量避免加样误差，影响标准曲线 仪器检测通道选择 单一微生物 报告荧光 淬灭荧光 NG/CT/UU FAM None β-globin HEX/JOE None CT/NG/UU联合 报告荧光 淬灭荧光 CT FAM None NG HEX/JOE None UU ROX/Red 610 None β-globin Cy5 None 乙肝病毒定量产品 对临床血清标本中的乙型肝炎病毒（HBV）核酸DNA的定量检测 样本类型&采集方法 血清样本 用无菌注射针头抽取患者静脉血2 ml，于无菌收集管中，室温放置不超过4 h， 1500 rpm离心5 min，吸取血清转入1.5 ml离心管中备用。 血浆样本 用无菌注射针头抽取患者静脉血2 ml，于含有EDTA作为抗凝剂的无菌收集管中，室温放置不应超过4 h，1500 rpm离心5 min，吸取血浆转入1.5 ml离心管中备用 样本保存 样本采集后，如若不能马上检测，应将样本置于冰箱2-8℃存放，并在72h内检测 -20℃保存不超过3个月 -70℃下长期保存 应避免反复冻融 DNA提取 1）取200ul样本于1.5ml离心管中 （血清/血浆/阴阳质控品/阳性标准品)； 2）加入20ul蛋白酶K； 3）加入200ul溶液L，混匀，56℃温浴10-15min； 4）加入200ul无水乙醇，充分混匀； 5）将全部液体转移至带收集管的硅胶柱中； 6）10000rpm离心1min，弃废液； 7）加入500ul溶液W1（确保已加入乙醇）； 8）10000rpm离心1min，弃废液； 9）加入500ul溶液W2（确保已加入乙醇）； 10）10000rpm离心1min，弃废液； 11）加入500ul溶液W2（确保已加入乙醇）； 12）10000rpm离心1min，弃废液； 13）空管离心，12000rpm离心3min，丢弃收集管； 14）将硅胶柱装入新1.5ml离心管中，开盖1-2min； 15）往硅胶柱中心加入60-200ul的TE，静置3-5min； 16）12000rpm离心2min，弃柱得DNA。 提取前，应将HBV内标加入到裂解液中溶液L：HBV内标=200 μl：0.5μl 温浴后，加样前应点动离心 乙醇可提取放于冰箱，低温可提高DNA的沉降效率 样本管编号与硅胶柱编号应一一对应 TE可提前预热，但温度不宜过高，可提高DNA的