拟南芥rd29A启动子的克隆及其在甘蔗抗逆转基因中的应用初探论文.pdf

生物技术 拟南芥rd29A启动子的克隆及其在甘蔗抗逆转基因中 的应用初探牛 张积森廖辉煌林晓坤陈如凯张木清 福州市，农业部甘蔗生理生态与遗传改良重点实验室，福州，350002 摘要从拟南芥(Arabidopsis 列分析表明该启动子具有两个干旱、高盐和低温响应顺式作用元件(DRE)，其他主要调控区域 也存在。用rd29A启动子构建了具有绿色荧光蛋白(GFP)基因的植物表达载体，通过基因枪导 入法转化甘蔗愈伤组织，在转化后3d和5d，NaCl胁迫条件下，用荧光显微镜观察GFP基因在 愈伤组织表达水平．结果表明rd29A启动子是NaCl诱导型启动子，可满足在盐胁迫条件下使目 的基因在转基因甘蔗中进行表达的目的． 关键词生物化学与分子生物学；甘蔗，rd29A；抗逆 干旱、高盐、冷害等逆境胁迫严重影响作物的生长和产量，为了适应这些逆境变化，作物在长期自然 选择条件下，形成了多种适应机制。植物在逆境条件下，会发生某些基因的表达，以调节自身对不利环境 的适应。国内外科研工作者在逆境胁迫诱导基因表达、基因调控以及信号转导等方面做了大量的工作【l川。 Yumaguchi．ShinozakiK等从干旱处理的模式植物拟南芥中克隆了一批受干旱诱导的基因，定名为rd to (responsive 分析其启动子，发现有一个与干旱、高盐及低温胁迫应答有关的DRE顺式作用元件。对阿拉伯芥和烟草进 行的研究表明，rd29A至少有2个顺式作用元件，一个对干旱胁迫和ABA诱导联合响应，另一个是由渗 透压的改变而诱导的16--7J。但rd29A基因目前在甘蔗转基因上应用还未见报道。 fluorescent 绿色荧光蛋白(green victoria)体内的一种发光蛋 protein，简称GFP)是海洋生物水母(Aequorea 结构，这一氧化和环化过程不需要任何外源底物或辅因子【8】。因此GFP作为报道基因具有稳定性好、可以在 多种异源细胞表达、对宿主细胞无毒害、荧光易于检测等诸多优点【9】。但野生型绿色荧光蛋[刍(wtGFP)荧光强 倍【lo】，目前GFP及其突变体作为新的报告基因和遗传标记已被广泛应用于植物研究中。 转入甘蔗愈伤组织，研究其在盐胁迫下对外源基因的控制表达，为rd29A在甘蔗抗逆基因工程中的应用 研究提供理论依据。 1 材料与方法 1．1材料 1．1．1菌株 大肠杆菌(E．coli)DH5a由本实验室保存。 1．1．2植物材料 学校博士学科点专项科研基金项目(20040389009) 117 中圜科协第四届优秀博士生学术年会论文集 转化的甘蔗品种福农95．1702为福建农林大学甘蘸研究所新培育的新品种；克隆拟南芥干旱诱导启动 1l 3主要生化试剂 成；DNAMarker．dNTPs捏合物购自上海生物工程有限公司其他试剂购国产分析纯试剂。 1．2方法 l 2I拟南芥干早酯导启动子RD29A的克隆 用CTAB法…1提取拟南芥(Arabidopsis 有限公司合成。PCR扩增反麻体积为50uL．包括0 10×buffer，2uLdNTPs(2．5 5ugDNA模扳．5uL mmolFL)，luL引物PI(20mmolPL)，luL引物P2(20mmolPL)，0．25uL 至50uL。反应条件为94℃坝变性5 rain。 rain；94C．45s，55℃．40s；72C．1min；35个循环后于72℃保温延伸5 的连接．然后转化大肠杆茁DHSa，(抗生素为100raglJlAmp)挑单茁、落进行重组质粒的鉴定。克隆的FCR产 物序列由上海生工生物工程公司测定。测序结粜用PCgene软件进行序列分析． 1