M5pZEROBlunt零背景平末端.doc

M5 pZERO-Blunt 零背景平末端 快速连接试剂盒使用说明书 产品名称 单位 货号 M5 pZERO-Blunt Kit 20T MF131-01 M5 pZERO-Blunt Kit 4x20T MF131-04 【储存条件】 长期保存，请置于-20?C，有效期12个月。 【产品简介】 零背景平末端快速连接试剂盒是一种先进的自杀基因阳性选择克隆系统，可以高效克隆平末端 PCR 产物和任何具有平末端的DNA 片段。该试剂盒对磷酸化或非磷酸化的 DNA 片段都有效。 阳性选择载体和插入片段连接仅需 5 分钟即可获得超过 90%的阳性重组克隆。由具有校正活性的聚合酶（如：X5，Q5，Phusion，KOD等）扩增的平末端 PCR 产物可直接连入克隆载体。连接产物可直接转化常用的大肠杆菌菌株。 本试剂盒提供一个新颖的自杀基因阳性选择克隆载体pZERO-Blunt。该载体含有致死的自杀基因，当载体与片段连接成功，自杀基因无法正确表达，包含重组子的细胞可以正常生长；当载体与片段连接不成功，载体自连后自杀基因正确表达，包含自连空载体的细胞无法存活，即“零ZERO”背景。这种阳性筛选策略无需蓝白斑筛选，极大地加速了克隆筛选进程。 为方便酶切作图和插入片段基因操作，pZERO-Blunt克隆载体的多克隆位点两侧各包含一个BglII识别序列。此外，该载体含有T7启动子，可用于体内或体外转录、插入片段测序等研究。 【产品组分】 组分名称 20 T 4x20 T pZERO-Blunt Vector (40ng/μl) 20 μl 80 μl 1K bp Control (40ng/μl) 5 μl 5 μl T4 DNA Ligase, 5U/μl 20μl 80 μl 2x Quick Ligation Buffer 100μl 400μl pZERO-Blunt Forward Sequencing Primer (10μM) 100μl 400μl pZERO-Blunt Reverse Sequencing Primer (10μM) 100μl 400μl 【操作步骤】 连接反应的准备： 平末端PCR产物或者酶切后平末端片段可以通过琼脂糖凝胶电泳分离回收（使用长波紫外光下切胶或者可见光透射切胶避免DNA损伤造成连接失败）。与载体的摩尔比是 3:1。本公司生产的DNA产物快速纯化回收试剂盒对70bp以上的DNA片段能很好地进行回收。 快速连接反应： 在一个标准的10 (l连接反应体系中，加入1 (l 40ng pZERO-Blunt载体、X (l PCR产物 (在通常状况下，没有必要对PCR产物进行精确定量，一般PCR产物与载体的摩尔比优化至1:1~10:1就可以得到良好结果，推荐3:1，见附录)、5(l 2 ( Quick ligation Buffer和0.9(l 的T4 DNA Ligase，其余用灭菌水补足。 反应按以下体系进行： 2 ( Quick Ligation Buffer 5(l pZERO-Blunt载体 1(l 纯化后的PCR产物/或者1(l 1000bp control X(l 灭菌水 Y(l T4 DNA Ligase 0.9(l (5 Weiss Units/(l) Final Volume 10(l 一般最后加入T4 DNA Ligase。 22℃连接5-10分钟（一般可在PCR仪器完成）。 通常推荐22℃连接5-10分钟 ，>3kb长片段连接可以延长至30分钟。不推荐超过30分钟，超过可能降低转化子数量。 冰上冷却，然后转化或贮存于-20℃。 转化： 100(l感受态细胞，置于冰上，完全解冻后轻掸几次将细胞均匀悬浮。 加入4－5(l连接液(最多可全部加入，只要连接液体积不超过感受态细胞体积的1/10)，轻轻混匀。冰上放置30分钟。 42℃水浴热激90秒。冰上放置2~3分钟。 加500(l LB或者SOC