体外DNA连接概念.pptxVIP

实验五 体外DNA连接;原理;材料;载体;目的DNA片段;限制性内切酶消化;限制性内切酶;第1个字母取自产生该酶的细菌属名，大写 第2，3二个字母取自它来源细菌的种名的头2个字母，小写 第4个字母代表株 最后用大写罗马数字，代表同一菌株中不同限制酶的编号;限制性内切酶的类型; 首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年从流感嗜血菌Rd菌株中分离出来。 ; 一般性状 对热不稳定，通常是溶于含有50％甘油的缓冲液中贮存于–20℃环境下。取出使用时必须立即置于冰浴中。NaCl有抑制作用，能被Mg2+激活，巯基有保护作用， 识别序列 通常识别的是4-8bp的回文序列，多为6bp，在识别序列内或其附近水解DNA链中的磷酸二酯键。;酶切切口 齐平末端：在识别序列内的对称轴上切割，其 切割产物具平头末端（不易重新连接）。 粘性末端：在识别序列2条链对应位上错位切割，有5’端突出的粘性末端和3’端突出。 ; 5’NNNNNNGTTAACNNNNN3‘ 3’NNNNNNCAATTGNNNNN5‘;5’NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN3’ 3’NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN5’;Pst I的识别序列和酶切切口（粘端）;;PCR产物双酶切连接;利用限制性内切酶的连接;PCR产物T载体连接;;pMD19－T 载