碱变性法抽提质粒DNA.pptVIP

第一次实验 碱变性法抽提质粒DNA 核酸电泳及分子量测定 核酸浓度和纯度分析 质粒DNA的内切酶切 核酸浓度和纯度分析 DNA浓度测定： 在260nm的紫外线下， 1OD光密度值相当于双链DNA浓度为50ug/ml, 单链DNA或RNA为40ug/ml,可据此计算核酸浓度。 核酸浓度和纯度分析 DNA纯度测定： 分光光度法可通过测量260nm和280nm处的吸光度值的比较，即OD260/OD280, DNA: 1.8 RNA: 2.0 质粒电泳及DNA分子量测定 核酸在pH8.0~8.3的缓冲液中，碱基不解离，磷酸全部解离，带负电荷，向正极泳动。 电泳凝胶 示踪染料 常用溴酚蓝或二甲苯青为示踪染料指示迁移过程 溴酚蓝呈蓝紫色,在1﹪琼脂糖凝胶电泳中迁移率与长600bp的线性双链DNA相同 溴化乙锭 溴化乙锭（EB）：一种荧光染料,可嵌入核酸双链的配对碱基之间,在紫外线激发下发出橙红色荧光 配制凝胶中加入,在凝胶中的终浓度为0.5μg/ml,但线性DNA的电泳迁移率降低约15%----聚丙烯酰胺凝胶灌制是不能掺入EB 也可在电泳后用含EB（ 0.5μg/ml）的电泳缓冲液浸泡,室温染色30~45min 具有高致癌性，谨慎操作 DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的影响因素 ⒈ DNA的大小：分子越大，迁移的越慢 ⒉ 琼脂糖浓度：浓度越大，迁移越慢 ⒊ DNA的构型：超螺旋型线型开环型 ⒋