分子生物学基实验操作.pptVIP

HEADLINE 2.3.4 PCR体系的优化 PCR反应条件视模板、引物的结构条件不同而各异，在实际操作中需根据 模板来源、目的片段的大小及碱基组成、引物性质等的具体情况摸索出最佳 反应条件。 （1）引物退火温度 退火温度是PCR实验的一个重要参数，对PCR的特异性有很大影响。一般根 据所设计引物退火温度上下5℃来进行梯度实验，摸索出适合的退火温度； （2）引物浓度 引物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓度一般在0.1到0.5μM，较高的引 物浓度会导致非特异性产物扩增； 2.3.4 PCR体系的优化 （3）镁离子浓度 ??? 可以从1mM到3mM，以0.5mM递增，进行镁离子浓度梯度实验； （4）循环参数 在PCR的前5-10个循环使用严紧的退火温度，使 特异性产物得到优先扩 增，然后在一个较低的退火温度下反应20-30个循 环；也可以使PCR反应在 一个高的退火温度下开始，然后每个循环降低0.5℃到2℃，直到退火温度低 于引物设计温度5℃； 2.3.4 PCR体系的优化 （5）热启动 冰上配制PCR反应液，将其置于预热的PCR仪上开始反应；另外还可利用具 有 热启动功能的DNA聚合酶来实现热启动； （6）巢式PCR 对于一些较难扩增的模板，可以进行巢式PCR扩增，以提高特异