4%多聚甲醛配置.docx

4%多聚甲醛配置： (4%是指4g多聚甲醛固体溶于OOmL PBSW 先配好PBS 称取4g多聚甲醛固体 将多聚甲醛放入PBS中水浴锅65C加热3h 注意：1.先配现用，多聚甲醛容易挥发。上午使用，前一天下午配置; 下午使用，当天上午配置。 多聚甲醛有毒，使用时要在通风橱中进行并配戴口罩 40g多聚甲醛固体t 1L PBS 120g多聚甲醛固体t 3L PBS 药品 用量 PBS 1L NaCl 8g KCl 0.2g Na2HPO4 12出0 2.88g KH2PO4 0.2g 加三次水，1L定容 取50只小鼠，1只小鼠注射20mL 4%的多聚甲醛溶液，共需 1000mL~，故要配置 1、5L的 4%的多聚甲醛溶液 从组织中提取总蛋白 组织匀浆 8mL裂解液 8mL RIPA+8QL PMSF( 100x) +190.5丄cocktail (100x) 1mL RIPA+10L PMSF( 100x) +23.8丄cocktail (100x) 裂解：取少量组织+600 □裂解液匀浆t 4 C振荡裂解45mint4C 离心 12000r/min，离心 15min 稀释：取3^1上清+27卩无菌水t BCA试剂盒 以A液：B液=50: 1的比例混合t样品25卩L混合液200卩L(设置三组平行对照) 温敷：37C下温敷30mint570nm下检测OD1.0左右t测蛋白浓度， 计算50卩g/70 ^g寸应体积和 buffer体积宀5x buffer，最大上样量 十4二buffer体积 变性：100C煮沸10min, -80C保存 组织总RNA提取 取小鼠肝组织50~100mg加人ImLTrizol ?试剂，置于碾钵中快速 研磨，样品体积不超过 Trizol TM的10%匀浆后的样本于室温孵育 5 m i n （使核蛋白复合物完全融解 ）, 再加人 0.2mL 氯仿, 盖好样本管盖 , 用手剧烈振荡15s后室温静置3min;4C下,12000r/min离心15min（离 心后混合物分为下层红色的酚、氯仿相 , 中间相和无色的上层水相。 RNA分布于上层水相，水相占总体积60%取上清液转人另一样品管， 并加人0.5mL异丙醇，混匀后室温放置10min; 4C下,12000r/min离 心10min。弃上清液，并用焦碳酸二乙酯（DEPC处理过的双蒸水（ddf。） 配置的75%乙醇1mL洗涤沉淀物，振摇后沉淀。然后在4 °C 下,7500r/min 离心5min。真空干燥5~10min或吸尽乙醇开盖挥发， 弃上清液，敞开关口，凉干沉淀；最后溶沉淀于50uL RNase-free ddH2O 中。-70 C保存。