核酸分子杂交.ppt

核酸分子杂交技术

基因工程研究所

第一节核酸分子杂交的基本原理核酸的变性与复性核酸分子杂交的基本原理第二节核酸探针常见的核酸探针核酸探针的标记第三节核酸分子杂交相关技术传统的核酸分子杂交技术原位杂交第一节核酸分子杂交的基本原理一、核酸的变性与复性（一）变性当有酸、碱、热及某些变性剂（如尿素、乙醇、甲酰胺、胍等）等变性因素存在时，DNA分子双链间的氢键断裂，解离成两条无规则的卷曲状单链DNA，此现象称为变性（denaturation）。DNA变性后，由于双螺旋解体，碱基堆积不再存在，藏于螺旋内部的碱基暴露出来，从而使变性后的DNA对260nm紫外光的吸光率比变性前明显增加，这种现象称为增色效应（hyperchromiceffect）。加热使DNA变性是实验室最常用的方法，称为热变性，DNA热变性发生在一个狭窄的温度范围内。通常将DNA变性达到50%时（即增色效应达到一半时）的温度称为解链温度或熔解温度（meltingtemperature），用Tm表示。影响Tm值的因素：①DNA的碱基组成。DNA的G、C含量越高，Tm值越大；A、T含量越多，Tm值越低。这是因为G-C碱基对含有三个氢键，比含有两个氢键的A-T碱基对在维持DNA的双螺旋结构中稳定性强。在标准条件下（0.15mol/LNaCl，0.015mol/L柠檬酸钠溶液中），Tm值与碱基对组成之间的经验公式为：Tm=69.3+0.41(G+C)%。②溶液的离子强度。溶液的离子强度增高，Tm值增大，解链温度范围较窄。这是因为DNA双链骨架上带有较多的负电荷，它们之间的静电排斥作用是双链不稳定的因素之一，而溶液中的正离子可以封闭磷酸基团的负电性，使DNA比较稳定。③溶液的pH值。核酸溶液的pH值在5～9范围内，Tm值变化不明显。当溶液pH值小于4或大于11时，均不利于氢键的形成。④变性剂。各种变性剂主要是干扰碱基堆积力和氢键的形成而降低Tm值。核酸在变性过程中，除紫外吸收值变化之外，还有粘度下降、沉降系数增加、比旋度降低、生物活性丧失等．（二）复性去除变性因素后，单链DNA能通过碱基互补重新结合成稳定的双链螺旋结构，此过程称为复性（renaturation）。DNA复性后，许多理化性质和生物活性也得到恢复。复性过程基本上符合二级反应动力学，其中第一步是相对缓慢的，因为两条链必须依靠随机碰撞找到一段碱基配对部分，先形成部分双螺旋。第二步快得多，尚未配对的其他部分按碱基配对相结合，像拉锁链一样迅速形成双螺旋。退火（annealing）：热变性DNA在缓慢冷却时，可以复性，这种复性称为退火。“淬火”（quench）：将热变性的DNA骤然冷却时，DNA不可能复性，这是由于温度突然降低，单链DNA分子失去碰撞的机会，因而不能复性，仍然保持单链变性的状态。将热变性DNA骤然冷却的处理过程叫“淬火”。利用“淬火”的原理，在用同位素标记的双链DNA片段进行分子杂交时，为获得单链的杂交探针，可将装有热变性DNA溶液的试管直接插入冰浴，使溶液在冰浴中骤然冷却至0℃。影响DNA复性的因素：①DNA的大小及复杂性。DNA片段越小、序列越简单，复性速率越快。因为片段越大、复杂性越高，单链DNA分子相互碰撞的几率越少。②DNA的浓度。DNA浓度越大，两条互补链相互碰撞的可能性越大，复性的速度也越快。③温度。温度过高，不利于DNA的复性；温度过低，则少数碱基配对形成的局部双链不易解离，难以继续寻找正确的配对。适宜的复性温度是比Tm值低25℃。④溶液的离子强度。因为盐能中和DNA单链中磷酸基团的负电性，减少互补链的负电荷相互排斥作用，因此增加盐浓度，可加速两条互补链重新结合的速度。二、核酸分子杂交的基本原理根据核酸变性和复性的原理，不同来源的DNA变性后，若这些异源DNA之间存在某些相同序列的区域，在退火条件下则可形成DNA-DNA异源双链；或将变性的单链DNA与RNA经复性处理可以形成DNA-RNA杂合双链。这种不同来源的单链核酸分子在合适的条件下，通过碱基互补形成双链杂交体的过程称为核酸分子杂交（molecularhybridization）。第二节核酸探针一、常见的核酸探针（一）基因组DNA探针基因组DNA探针的制备是将染色体DNA通过超声击断或限制性内切酶不完全水解，获得许多染色体DNA的随机片段，选择长度约15-20kb的DNA片段重组到λ噬菌体中，经体外包装感染大肠杆菌，在固体培养基上形成许多噬菌斑。筛选出含目的基因的重组体后，将目的基因DNA片段再次亚克隆到大肠杆菌质粒中保存，以便需要时扩增。基因组DNA制备还可以通过PCR扩增基因组DNA的特定片段，