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LAMP扩增技术联合CRISPR-Cas12a系统对单增李斯特菌快速检测的研究

罗筱1，徐颖1，陈杰1，黄香1，施豪2

浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江杭州310000；

浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江杭州310000）

摘要：为实现单增李斯特菌的现场快速检测，本实验构建了CRISPR-Cas12a系统辅助环介导等温扩增（LAMP）的DNA检测方法。利用LAMP反应能够快速且高效特异性地扩增靶序列来放大检测信号；利用CRISPR-Cas12a系统在检测到靶序列后能够非特异性切割单链DNA，将有荧光基团和猝灭基团修饰的单链DNA作为探针，对LAMP扩增后的靶序列进行检测。在获得荧光曲线图的基础上自制工具，对实验结果的荧光进行观察。本研究基于LAMP技术和CRISPR-cas12a建立的检测单增李斯特菌的体系可在3h内完成反应，检出限为0.362pg/μL，检测时间较短且灵敏度较高。闭管体系的建立，为现场快速检测和减少假阳性产生提供了一种通用的方案。

关键词：LAMP、CRISPR-Cas12a系统、单增李斯特菌、快速检测

PreliminaryStudyonDetectionMethodofListeriaMonocytogenesbyLAMP

AmplificationCombinedwithCRISPR-Cas12aSystem

单核细胞增生李斯特菌（Listeriamonocytogenes），简称单增李斯特菌，在自然界中广泛存在。可通过乳制品、肉制品、水产品等感染人类[1]，严重感染会引起脑膜炎、败血症等，严重威胁人类健康[2]，是WHO要求重点检测的食源性致病菌[3][4]。目前采用的检测技术以传统微生物检测为主，如国标微生物学检测法，虽然设备简单、成本低廉，但是操作烦琐、检测周期长[5]，不能满足企业生产的需求[6]。而荧光定量PCR方法操作繁琐，对实验室的环境和操作人员要求较高，不符合现场快速检测的条件。因此，迫切需要建立一种能够符合现场快速检测且准确、安全、低成本的检测方法[7]。

环介导等温扩增技术（loop-mediatedisothermalamplification，LAMP），是一项特异性高，灵敏度强的核酸扩增技术[8]。以靶序列的6个不同区域设计4种不同的特异性引物（内外引物各两对）[9]，在链置换DNA聚合酶作用下反应[8]，通过哑铃状扩增模板合成、链循环扩增、链伸长和再循环[10]，1h即可实现目标序列的高效特异性扩增。LAMP扩增不需要专业人员，不依赖特定实验设备，灵敏度高且耗时短，满足现场检测的需求[11][12]。CRISPR-Cas系统，是由成簇、规律间隔短回文重复序列以及一系列关联蛋白构成，从来源看是属于细菌与古菌细胞中的一种获得性免疫系统[13]。当Cas12a蛋白结合crRNA和目标DNA片段并切割目标DNA后，反式DNA切割活性被激活[14]，便会非特异性切割单链DNA[15]。通过设计crRNA来定位靶序列，并使用单链DNA荧光报告分子作为信号探针，如图1所示。当检测体系中存在靶序列时，Cas12a系统的反式切割活性被激活，将荧光报告分子的DNA单链切断[16]，使得荧光分子发光，通过荧光强度可以指示靶DNA的存在。

材料与方法

材料和仪器

单增李斯特菌（Listeriamonocytogenes）(ZOOF-583）为实验室保存；细菌DNA分离试剂盒购自

TIANGEN公司；DNA、RNA材料（表1）均购自上海生工生物技术有限公司，并以HPLC进行纯化；dNTP

表1ssDNA、RNA序列

Primer Sequence（5’to3’)

F3 AGTTGTGAATGCAATTTCGA

B3 CTGCGTTGTTAACGTTTGA

FIP AGGGAGAACATCTGGTTGATTTTCTCCTATCCAGGTGCTCTCGBIP CGTGATTCATTAACACTCAGCATTGGTGGCATTTTTTACAACGATT

NCRNA UUGUACUACACAAAAGUACUG

crRNA UAAUUUCUACUGUUGUAGAUCCAGGUAUGACUAAUCAAGA

单链DNA探针 BHQ1-TTATT-6-FAM

25mMMixture、BstDNAPolymerase、细菌琼脂粉、BHI培养基、琼脂糖、TAE溶液、海藻糖、甜菜碱、MgSO4、DEPC水购自上海生工生物技术有限公司；DL2000PlusDNAMar