基因工程课后题.pdf

．质粒DNA和病毒（噬菌体）DNA作为载体的主要特征是什么

为外源基因提供进入受体细胞的转移能力；为外源基因提供在受体细胞中的

复制能力或整合能力；为外源基因提供在受体细胞中的扩增和表达能力；具有多

种单一的核酸内切酶识别切割位点，具有合适的选择标记

3．如何理解质粒的不相容性及其在DNA重组克隆过程中的运用意义

质粒的不相容性：具有相同或相似复制子结构及调控模式的两种不同的质粒

不能稳定存在于同一受体细胞内.

4．列举表达质粒、穿梭质粒、探针质粒和cos质粒的不同用途

表达质粒:在多克隆位点的上下游分别装有两套转录效率较高的启动子、合

适的核糖体结合位点序列（SD）序列以及强有力的终止子结构，使得克隆在合适

位点上的任何外源基因均能在受体细胞中高效表达。

穿梭质粒：质粒分子上含有两个亲缘关系不同的复制子以及相应的选择性标

记，能在两种不同的受体细胞中复制并检测。

探针质粒：用来筛选克隆基因的表达调控元件。通常含有报告基因，但缺少

相应的调控序列（如启动子或终止子），只有含有启动子或终止子的调控序列被

克隆进入载体后，报告基因才能别表达，表达量的大小直接反应了克隆进入的调

控元件的强弱。

cos质粒：人工构建的含有λDNA的cos位点序列和质粒复制子的特殊类型

的质粒载体。具有大的装载量，可以用于构建基因组文库。

5．II类限制性核酸内切酶的主要酶学特征是什么

分子量较小的单体蛋白，双链识别和切割活性仅需Mg，识别位点为4-6个

bp的回文序列，切割位点在识别序列中或靠近识别序列

7．KLenow酶与大肠杆菌DNA聚合酶I在结构和功能上的主要区别

DNA聚合酶I包括大片段(klenow片段)和小片段

功能上：DNA聚合酶I比klenow酶多了5’→3’核酸外切酶活性，两者都具有

5’→3’DNA聚合酶活性和3’→5’核酸外切酶活性。

8．影响限制性核酸内切酶活性的主要因素有哪些？

温度、盐度等物理因素，DNA样品纯度，DNA甲基化程度，限制性核酸内

切酶的缓冲液性质，甘油和微量的金属离子会抑制限制性内切酶的活性

9.如何理解粘性末端比平头末端更容易连接

在退火条件下，粘性末端的连接为分子内反应，平头末端是分子间反应，平

头末端的连接反应更加复杂，速度也慢。因为一个平头末端的5’磷酸基团或3’

羟基与另一个平头末端的3’羟基或5’磷酸基团同时相遇的机会显著减少，通常平

头末端的连接速度比粘性末端慢10-100倍。

11．为什么外源DNA难以转化野生型的微生物受体细胞

野生型细菌有针对外源DNA的限制和修饰系统，外源DNA会被识别，从而

被降解，要选择限制系统缺陷型的受体细胞（限制缺陷型）；外源基因克隆、扩

增以及表达是建立在DNA重组分子自主复制的基础上的，受体细胞必须选择体

内同源重组缺陷型的受体细胞（重组缺陷型）；用于基因工程的受体细胞必须对

重组DNA分子具有较高的可转化性，利用遗传诱变技术改变受体细胞壁的通透

性，从而提高其转化率（转化亲和型）

13．简述转化子筛选与重组子鉴定的三大基本战略

载体遗传标记检测：抗药性检测，营养缺陷型检测；

克隆DNA序列检测：限制性酶切图谱法，菌落原位杂交法，PCR扩增法

14．探针、引物、接头的物质基础和用途分别是

探针:小段单链DNA或RNA,序列可以是已知的或未知的，带有标记（放射性

/非放射性），用于检测与其互补的核酸序列；

引物：小段单链DNA或RNA，序列是已知的，长度为16-30bp，作为DNA

复制的起点

接头：平头双链DNA，更换粘性末端

15．简述分离克隆目的基因四大战略及其适用范围

鸟枪法：将某种生物体的全基因组或单一染色体切成大小适宜的DNA片段，

分别连接到载体DNA上，转化受体细胞，形成一套重组克隆，从中筛选出含有

目的基因的期望重组子。为保证覆盖整个基因组，需要测远远超过基因组大小的

序列；适合较小的基因组；测序后需要填补一些空白；适合没有重复序列的基因

组，如果有大量的重复序列，不能保证正确的组装。

cDNA法：获得mRNA，除去内含子

PCR法：知道基因的两侧序列或中间序列

化学合成法：知道全基因序列，小片段连接法，补丁延长法，大片段酶促法

16．简述基因文库的基本概念以及构建技术要点。

基因文库：基因组