植物发育生物学研究方法.ppt

RNAi引发的基因沉默机制GiselaStorz,Science,296(5571):1263-1265,2002.第31页,共53页，2024年2月25日，星期天RNAi在植物与其他生物中的差异在植物中存在系统性沉默(systematicRNAsilencing)现象，RNAi不会局限于单个细胞内，可以在细胞与细胞之间、甚至由诱导部位向更远的组织传播。植物中存在转移性沉默(transitiveRNAi)，对于转基因植物中的外源基因，如果dsRNA诱导的RNA沉默区域对应于基因的中间区域，能检测到与其侧翼区段对应的siRNA。但内源基因却缺乏转移性沉默，表现出沉默区域的保守性。这两种现象在线虫中也有发现,但在哺乳动物和昆虫中却没有发现类似的现象。植物中的RNAi跟两种不同大小的siRNA有关：21nt和24ntsiRNA，21nt由RISC指导切割目的mRNA，而24nt则引发了系统性沉默和甲基化；而在动物中仅发现21nt的siRNA。第32页,共53页，2024年2月25日，星期天RNAi研究的一般技术路线第33页,共53页，2024年2月25日，星期天RNAi的效果分析可从mRNA和蛋白质两方面进行。mRNA：RT-PCR；定量PCR；Northern杂交等。蛋白质：Western杂交；ELISA；免疫荧光等。细胞的代谢过程，生理生化系数等表型参数的变化是RNAi效果最终和最大的体现。第34页,共53页，2024年2月25日，星期天RNAi在植物功能基因组研究中的应用RNAi为大规模高效及复杂的功能基因组学研究提供了一个便捷的平台。Chuang等在花发育研究中采用RNA沉默技术验证了AG、CLV3、APl、PAN等已知功能基因,并开创了RNA沉默技术在植物功能基因组学中的应用。Miki等利用水稻OsRac基因家族保守性序列设计RNA沉默载体，成功的对OsRac基因家族进行了沉默，发现该突变株系生长状况和植株高度均比正常的要差，揭示该基因家族在生长发育过程中有重要的作用第35页,共53页，2024年2月25日，星期天RNAi在作物品质改良中的应用尽管产量问题在传统育种和植物遗传工程研究中是最重要的目标,改善植物营养价值方面也越来越受到重视。常规育种方法在改善食物营养方面取得了卓有成效的成功，然而操作耗时，并且对于作物性状的改良只限于已经得到的突变体材料而利用RNA沉默技术，其优越性不仅表现在可操作基因的范围和突变的种类扩大了，而且对目的基因的表达有了可控性第36页,共53页，2024年2月25日，星期天利用RNA沉默产生抗病毒植物将病毒的某一序列设计成双链结构导入植物体使之表达,可诱发RNA沉默强化植物体内天然的RNA沉默抗病毒能力，这使得高抗病毒性的转基因植物的获得成为可能。Waterhouse等利用马铃薯Y病毒(PVY)蛋白酶基因片段构建IRS载体进行烟草转化，获得抗性植株。Wang等利用含有大麦黄矮病毒(Barleyyellowdwarfvirus，BYDV)PAV株系的复制酶基因片断构建成可产生发夹式RNA结构的载体，并将该载体导入大麦得到强抗性植株并得到稳定遗传第37页,共53页，2024年2月25日，星期天内源RNAi第38页,共53页，2024年2月25日，星期天蛋白质相互作用研究技术

第39页,共53页，2024年2月25日，星期天蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主要完成者。几乎所有的重要生命活动，包括DNA的复制与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢等等，都离不开蛋白质之间的相互作用。蛋白质之间相互作用研究的重要性第40页,共53页，2024年2月25日，星期天酵母双杂交谷胱苷肽-S-转移酶沉淀试验(GST-pulldown）免疫共沉淀双分子荧光互补技术(BIFC)生物发光共振能量转移（BRET）技术常用蛋白质相互作用的研究技术第41页,共53页，2024年2月25日，星期天一、细菌双杂交系统Two-hybridsystem是90年代初发展起来的新方法，可用于分离能与已知靶蛋白质（targetprotein）相互作用的基因。基本原理：

真核生物的转录因子大多是由两个结构上分开、功能上独立的结构域组成的,如GAL4（酵母转录激活蛋白Gal4的基因）。这两个结构域各具功能，互不影响。但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域，否则无法完成激活功能。第42页,共53页，2024年2月25日，星期天酵母激活因子GAL4：N端：147个氨基酸组成的DNA结合域(BD