第四节--离子交换层析(第二章).ppt

第四节离子交换层析一离子交换层析的基本原理离子交换层析(ionexchangechromatography,IEC)是最常用的层析方法之一。它是以离子交换剂为固定相，盐溶液为流动相的液相层析方法。离子交换剂是由基质、功能基团和反离子构成。在水溶液中离子交换剂上的反离子可以与溶液中的带相同电荷的离子或基团可逆交换，并且保持理化特性不变。RA＋B＋＝RB＋A＋1、原理生物大分子如蛋白质、核酸等多价电解质有不同的分子大小及电荷排列方式。离子交换剂是通过化学键合的方法向惰性支持物上连接可解离的化学基团后的产物。可人为选择性地使其带有正电荷或负电荷。当在一定pH下净电荷为负的蛋白质分子可通过静电键结合到带正电荷的离子交换剂(称为阴离子交换剂)上；反之，称为阳离子交换剂。大分子依其与离子交换剂亲和力的不同，而在以不同牢度被吸附于离子交换剂，通过改变离子强度或(和)pH使大分子再从离子交换剂上先后被洗脱下来。离子交换层析示意图2.离子交换层析的应用1)水处理离子交换层析是一种简单而有效的去除杂质及各种离子的方法，聚丙乙烯树脂广泛的应用于高纯水的制备、硬水软化以及污水处理等方面。2)分离纯化小分子物质离子交换层析广泛应用于无机离子、有机酸、核苷酸、氨基酸、抗生素等小分子物质的分离纯化。例如对氨基酸的分析使用强酸性阳离子聚苯乙烯树脂，将氨基酸混合液在pH值为2～3上柱。这时氨基酸都结合在树脂上，再逐步提高洗脱液的离子强度和pH值，这样各种氨基酸将以不同的速度被洗脱下来，可以进行分离鉴定。全自动氨基酸分析仪就是采用这种原理制成。3)分离纯化生物大分子物质离子交换层析是依据物质的带电性质的不同来进行分离纯化的，是分离纯化蛋白质等生物大分子的一种重要手段。由于生物样品的复杂性，一般很难只经过一次离子交换层析就达到高纯度，往往要与其它分离方法结合使用。使用离子交换层析分离样品要充分利用其按带电性质来分离的特性，只要选择合适的条件，通过离子交换层析可以得到较满意的分离效果。二离子交换剂的类型离子交换剂根据表面所带电荷可分为：带正电荷的阴离子交换剂；带负电荷的阳离子交换剂。依据随pH变化，带电基团解离程度变化的不同，离子交换剂又分为强酸、强碱型和弱酸、弱碱型两类。DEAE阴离子交换剂、CM阳离子交换剂表面电荷随周围环境pH值的变化而减少或增加。层析剂颗粒小(10,15or30μm)可获得高分辨率，但洗脱流速受限。常用于分析，或微量制备。三离子交换柱层析与操作1.层析剂选择根据目标物的电荷特性选择阴离子，或阳离子交换剂。根据获得电荷差异所要求的缓冲液pH选择强，或弱离子交换剂。近中性pH选择弱离子交换剂，反之选择强离子交换剂。根据对目标物纯化程度或级别的要求，选择适合分离纯化要求的不同类型层析剂。如高分辨率的细颗粒层析剂，或大容量低分辨率的大颗粒层析剂。最高分辨率，细颗粒，小制备量(?g/run,mg/run).高分辨率，中等颗粒度(30-40?m)。可以扩大制备量。一般分辨率，较大制备量，较大颗粒度(60-90?m)。低分辨率，快速大容量，大颗粒度(90-200?m)最高分辨率，细颗粒，小制备量(?g/run,mg/run).高分辨率，中等颗粒度(30-40?m)。可以扩大制备量。一般分辨率，较大制备量，较大颗粒度(60-90?m)。低分辨率，快速大容量，大颗粒度(90-200?m)2.洗脱液的选择缓冲液的选择原则是：在离子交换剂允许的pH范围内，选择某一pH缓冲液，它能使被分离物产生最理想的净电荷差异。但是，缓冲液的pH需要通过一系列的实验来确定。缓冲液的离子强度，或盐浓度可以通过浓度梯度溶液洗脱实验来确定。3.离子交换层析与柱层析洗脱曲线相关的术语4.离子交换层析操作1).离子交换剂预处理和再生离子交换剂(DEAE－52阴离子交换剂)在使用前一般需用0.5mol/L的HCl和mol/LNaOH预处理。具体做法是：先用0.5mol/L的HCl浸泡阴离子交换剂(或用浸泡阳离子交换剂mol/LNaOH)30－40分钟，抽虑除去HCl(或NaOH)并水冲洗至近中性；再用0.5mol/LNaOH浸泡阴离子交换剂(或用0.5mol/LHCl浸泡阳离子交换剂)30－40分钟，抽虑除去NaOH(或HCl)；最后用0.5mol/LHCl(或用0.5mol/