southern 印迹法分析和总结.docx

实验七 Southern印迹法

[目的]

１．熟悉Southern印迹法的基本操作方法和主要步骤的工作原理。２．了解Southern印迹的意义。

[原理]

Southern印迹法(SouthernBlot)是将基因组DNA经限制性内切酶酶解、琼脂糖凝胶电泳分离，使DNA片段按分子量大小排列在琼脂糖凝胶上；经碱处理凝胶使DNA变性(使双链DNA变成单链)，通过具有一定盐离子浓度溶液的虹吸作用，将凝胶中变性的单链DNA片段原位地吸印到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上；经过干燥或紫外线照射处理，单链DNA片段的极性基团与支持膜上的基团结合而使DNA分子牢固地固定到转移膜上；转移后的单链DNA分子与32P或35S标记的DNA探针按互补原理进行杂交；经放射自显影对特定位置上显现的特异DNA片段进行分析。这种方法最初是由Southern于1975年建立的。方法中DNA转移的方式和复印的过程一样，比较准确地保持了特异DNA顺序在电泳图谱中的位置（也可将变性的凝胶负压干燥后与特定的DNA探针进行原位杂交）。它把电泳分离和杂交结合起来，不但能检测出特异的DNA序列片段，而且能进行定位和测定分子量。即先以电泳后照相记录的已知分子量的DNA片段(常用HindⅢ或EcoRⅠ降解的λDNA)为标准，精确测量各标准片段与电泳原点之间的距离。以DNA的Log10kb为纵坐标，移动距离(cm)为横坐标，连接各已知

条带相应的点，得到一条标准曲线。然后测量未知条带(放射自显影后获得的特异片段)的移

动动距离，在标准曲线上找出相应的Log10kb值，以此计算出其分子量大小。[器材与试剂]

一、器材1．电热真空干燥箱

硝酸纤维素滤膜或尼龙膜

大方瓷盘、带盖方盘、玻璃板

滤纸、吸水纸、保鲜膜、蜡膜（Parafilm）、一次性手套等

刀片、刻度吸管、镊子、剪刀、lkg重物二、材料

电泳分离DNA的琼脂糖凝胶三、试剂

酸变性液:0.25mol/LHCl，用分析纯的盐酸（12Mol/L）稀释

碱变性液：0.5mol/LNaOH，1.5mol/lNaCl（pH13.1）3．中和液：0.5mol/LTris·HCl(pH7.5),1.5mol/LNaCl4．20×SSC:0.3mol/Ｌ柠檬酸，3mol/LNaCl,pH7.0(配方见附录)

5．10×SSC和2×SSC：用双蒸馏水稀释20×SSC储存液

[实验步骤]

注意：操作戴手套！1．凝胶处理:

凝胶照像后，切去包括标记带在内的多余部分，将凝胶的一角(点第一个样品的一侧)切去作为标记，以便于定位。精确测量凝胶大小，然后将凝胶放入一个方形瓷盘中；

变性：将凝胶浸泡于适量的碱变性液中，室温下变性30分钟，期间更换变性液一次，不断地轻轻摇动（如果先进行酸变性酸变性，则凝胶中溴酚兰的颜色由黄变兰）。对于较大的DNA片段(如大于15kb)，凝胶可在碱变性前用0.25mol/LHCl预处理10分钟使DNA片段脱嘌呤（凝胶中溴酚兰的颜色由兰变黄）后再进行碱变性；

中和：移去瓷盘中的碱变性溶液，用双蒸馏水漂洗凝胶两次，然后浸泡于适量的中和液中，室温下轻轻摇动15分钟，更换新鲜中和液，再中和15分钟；

膜处理

剪下一张与凝胶面积相同的硝酸纤维素膜(NCP)或尼龙膜（NL）。注意NCP也要剪去一角且不可用手触摸，粘有油腻的膜不能被湿润，也不能结合DNA。同时剪8～10张与NCP等大的干净滤纸；

将NCP与3～4张滤纸依次漂浮于盛有双蒸馏水的带盖方盘中，使水自然从NCP的下面向上浸润，待其完全浸湿后，连同浸湿的滤纸一起浸入于转移液中浸泡5～10分钟。

注意：在蒸馏水中如NCP表面有气泡时，可将其放在65水浴中浸泡几分中，仍有气泡或不能完全被湿润(膜上有白色或黄色斑块)则不能用于转移。

转移

取一个较大的方形瓷盘，放一块玻璃板于盘上，盘内加转移液(6×SSC或10×SSC)使液面距离玻璃底面约1～2cm，玻璃板表面盖两张预先用转移液浸润的Whatman3M滤纸(也可用新华滤纸)，滤纸两端浸入SSC转移液中，用一玻璃棒将滤纸压平，滤纸与玻璃板间不得有气泡；

将琼脂糖凝胶翻转(样品孔朝下)后置于上述铺有Whatman3M滤纸的平台上，注意:两者之间不能有气泡。

用parafilm蜡膜将凝胶四周平台上裸露的滤纸封严，防止在转移过程中因短路(转移液直接从盘中流向吸水纸而不经过凝胶)使转移效率降低，甚至转移失败；

将处理好的NCP(已切去一角)小心地覆盖在凝胶上(滤膜的光泽面即标有N.C字样的一面