大肠杆菌聚合酶的作用与应用.ppt

CompanyLOGOCompanyLOGOCompanyLOGOCompanyLOGO关于大肠杆菌聚合酶的作用与应用大肠杆菌DNA聚合酶I的活性5’-3’DNA聚合酶活性15’-3’外切核酸酶活性23’-5’外切核酸酶活性3第2页,共13页，2024年2月25日，星期天5’-3’DNA聚合酶活性在引物RNA-OH末端，以dNTP为底物，按模板DNA上的指令由DNApolⅠ使DNA链沿5‘→3‘方向延伸。3Mg2+,dNTP553DNA聚合酶I第3页,共13页，2024年2月25日，星期天5’-3’外切核酸酶活性从5→3方向水解DNA生长链前方的DNA链，主要产生5-脱氧核苷酸。这种酶活性只对DNA上配对部分(双链)磷酸二酯键有切割活力作用，方向是5→3。3Mg2+553DNA聚合酶I第4页,共13页，2024年2月25日，星期天3’-5’外切核酸酶活性由3’端水解DNA链，反应底物是带3-OH的双链DNA或单链DNA，其活性从3-OH端降解ds-DNA，可被53聚合活性封闭，也可被带5磷酸的dNMP抑制5Mg2+Mg2+,dNTP335DNA聚合酶IDNA聚合酶I第5页,共13页，2024年2月25日，星期天活性能发生的反应切口平移置换反应活性第6页,共13页，2024年2月25日，星期天置换反应如果只有一种dNTP存在，35外切核酸活性将从3-OH端降解DNA，而53聚合酶活性又在合成DNA，然后在该位置发生一系列的合成和外切反应，直到露出与该dNTP互补的碱基。35外切酶活性5353聚合酶活性第7页,共13页，2024年2月25日，星期天切口平移首先在镁离子存在下用少量DNaseI处理双链DNA模板，产生少量切口。在切口处利用大肠杆菌DNA聚合酶I的5’-3’外切核酸酶活性是切口沿5’-3’方向移动，同时5’-3’DNA聚合酶活性又不断合成DNA。5Mg2+DNaseI35dNTP大肠杆菌DNA聚合酶I3第8页,共13页，2024年2月25日，星期天应用13’-端的末端标记2切口平移法标记DNA3合成cDNA的第二链第9页,共13页，2024年2月25日，星期天3’-端的末端标记先用此酶的3’