基因克隆的酶学基础.ppt

三、碱性磷酸酶（alkalinephosphatase）????主要来源于:牛小肠碱性磷酸酶（Calfintestinalalkalinephosphatase），简称CIP或CIAP细菌的碱性磷酸酶（Bacterialalkalinephosphatase,BAP）第89页,共107页，2024年2月25日，星期天作用催化除去DNA或RNA5‘磷酸的反应用于防止DNA片段自身连接，或标记（5‘端）前除DNA或RNA5磷酸第90页,共107页，2024年2月25日，星期天第91页,共107页，2024年2月25日，星期天第92页,共107页，2024年2月25日，星期天第四节?其它酶一、依赖于DNA的RNA聚合酶（DNAdependentRNApolymerase）????

SP6噬菌体RNA聚合酶（来源于感染鼠伤寒沙门氏菌LT2菌株）T4或T7噬菌体RNA聚合酶（来源于噬菌体感染的大肠杆菌）。第93页,共107页，2024年2月25日，星期天1．活性

????这些RNA聚合酶实际上为转录中的RNA合成酶，识别DNA中各自特异的启动子序列，并沿此dsDNA模板起始RNA的合成。它与DNA聚合酶不同，无需引物，但需识别特异性位点。2．用途

????①体外合成RNA分子。

????②用于表达外源基因。

第94页,共107页，2024年2月25日，星期天二、核酸外切酶（nuclease）?单链外切核酸酶大肠杆菌外切核酸酶I和VII：两头降解，产生2-25bp寡核苷酸片段双链外切核酸酶大肠杆菌外切核酸酶III:双链DNA从3‘OH末端开始降解，释放5’单核苷酸从dsDNA3‘-OH逐一去除单核苷酸的反应，底物为dsDNA或线状和带切口或缺口的环状DNA，反应结果是在dsDNA上产生长长的单链区。该酶还有对无嘌呤DNA特异性内切核酸酶活性、RNaseH活性和3‘-磷酸酶活性（去磷酸）。不降解核酸内的磷酸二酯键，也不降解单链DNA及带3‘突出的dsDNA。持续作用能力不强，产物为切割程度不相上下的群体，有利于分离长短不等的DNA。

第95页,共107页，2024年2月25日，星期天第96页,共107页，2024年2月25日，星期天三单链核酸内切酶1．BAL31核酸酶（BAL31nuclease）

来源于交替单胞菌（Alteromonasespejiana）BAL31主要活性为单链特异的核酸内切酶活性,从3’羟基末端迅速降解DNA依赖Ca++,而且EGTA(乙二醇-双-(2-氨基乙基)四乙酸）可抑制其活性。

双链的核酸外切酶活性：可从线性DNA两条链的两端迅速去除单核苷酸第97页,共107页，2024年2月25日，星期天用途从两头缩短DNA，用于构建嵌套缺失体制作DNA限制酶切图;确定DNA二级结构从单链RNA上去除核苷酸。第98页,共107页，2024年2月25日，星期天2．Sl核酸酶（S1nuclease）来源于米曲霉（Aspergillusoryzae）降解单链DNA或RNA，产生带5‘磷酸的单核苷酸或寡核苷酸双链,是一种高度单链特异的核酸内切酶对dsDNA、dsRNA和DNA:RNA杂交体不敏感。活性需pH4.0-4.3,Zn2+酶浓度大时可完全消化双链，中等浓度可在切口或小缺口处切割双链。作用：分析DNA:RNA杂交体的结构；去掉双链核酸中突出的单链尾从而产生平末端；打开双链cDNA合成中产生的发荚环。

第99页,共107页，2024年2月25日，星期天第100页,共107页，2024年2月25日，星期天3．核糖核酸酶A（RibonucleaseA或RNaseA）来源于牛胰，为内切核酸酶可特异攻击RNA上嘧啶残基的3‘端可用于除去DNA:RNA中未杂交的RNA区，确定DNA或RNA中单碱基突变的位置。广泛用来去除DNA样品中的RNA。

???

第101页,共107页，2024年2月25日，星期天4．脱氧核糖核酸酶Ⅰ（DNaseⅠ）来源于牛胰，是内切核酸酶可优先从嘧啶核苷酸的位置水解双链或单链DNA。产物是以5’-磷酸为末端的寡核苷酸。