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腺相关病毒(AVV)一种小的、非致病的、单链DNA病毒。是从属病毒,需要其他基因才能复制。结构:rep基因--编码病毒的复制、整合功能所需蛋白cap基因--编码病毒结构组分ITRs序列--反向末端重复,定义基因的开始和结束,制约DNA序列大小,包裹入衣壳。细胞对AVV病毒的亲和力高,AVV载体适用范围广泛。第63页,共73页,2024年2月25日,星期天骨髓细胞、皮肤成纤维细胞、肝细胞、血管内皮细胞、肌细胞选择原则:1、较坚固,耐受处理,易于由人体分离,便于输回体内。2、具有增殖优势,生命周期长,能存活几个月或几年,至病人的整个生命。3、易于受外源遗传物质的转化。4、在选用病毒载体时,目的基因具表达最好具有组织特异性的细胞3、选择靶细胞(禁止使用生殖细胞,只能用体细胞)第64页,共73页,2024年2月25日,星期天1、骨髓细胞:最被重视和常用的靶细胞。常用细胞:优点:⑴易接受各种处理、⑵已积累丰富经验,⑶多数遗传疾病涉及骨髓细胞、⑷源自骨髓的细胞遍布全身。缺点:-骨髓干细胞含量少(占骨髓细胞0.1%)-治疗基因在核骨髓细胞表达时间短(几个月)。-只有部分干细胞有活性-造血干细胞分化可能导致基因失活。-有些遗传疾病与骨髓干细胞无关。2、肝细胞:是许多遗传代谢缺陷的靶细胞。3、皮肤细胞:易于繁殖及转化。4、淋巴细胞:易采集、分离,大量繁殖,连续多次输入5、癌细胞:肿瘤治疗常用细胞。第65页,共73页,2024年2月25日,星期天方法:1、物理法:显微注射法电穿孔法基因枪技术2、化学法:磷酸钙沉淀法DEAE-葡萄糖法脂质体法3、融合法4、病毒感染法4、基因的转移第66页,共73页,2024年2月25日,星期天转染细胞后的筛选:方法:1、标记基因筛选法:2、基因缺陷型受体细胞的选择性3、基因共转染技术4、分子生物学方法:原位杂交Southern杂交斑点杂交目的基因或标记基因作为探针。第67页,共73页,2024年2月25日,星期天方法:(目的基因和标记基因的表达)原位杂交、Nouthern杂交、RNA点杂交(检测mRNA的转录)免疫组化染色(检测基因翻译出的蛋白质)5、外源基因表达的检测:第68页,共73页,2024年2月25日,星期天6、回输体内将治疗性基因修饰的细胞通过不同方式回输入体内,以发挥治疗效果。如:-淋巴细胞经静脉回输入血-造血细胞经自体骨髓移植-皮肤成纤维细胞经胶原包裹后埋入皮下组织第69页,共73页,2024年2月25日,星期天1、肝专一性表达:磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶启动子2、肌肉专一性表达:肌苷激酶的调控片段3、乳腺专一性表达:β酪蛋白,乳清酸蛋白4、黑色素专一性表达:酪氨酸和酪氨酸相关蛋白(TRP)5、胶质瘤专一性表达:鞘磷酸碱性蛋白基因上游片段6、肺癌专一性表达:人表面活性蛋白A与目的基因一起重组入反转录病毒,用于基因靶向表达。组织专一性表达的调节片段:第70页,共73页,2024年2月25日,星期天基因治疗的应用及展望应用治疗:遗传病(学友病、囊性纤维病、家族性高血压恶性肿瘤心血管疾病感染性疾病(AIDS、类风湿等)第71页,共73页,2024年2月25日,星期天呈待解决的问题:外源基因表达效率外源基因表达调控遗传性疾病面临的免疫问题反转录病毒载体随机插入的外源基因,若插入不当,可能破坏另一个基因的表达或激活其它基因(潜在的危险)。第72页,共73页,2024年2月25日,星期天感谢大家观看第73页,共73页,2024年2月25日,星期天AFLP原理:首先利用可产生粘性末端的限制性内切酶酶切研究对象的基因组序列,产生不同长度的酶切片段。然后,将这些酶切片段与含有与其有共同粘性末段的人工接头连接,形成模板。为达到选择性扩增的目的,再在模板末端添加具有选择性核苷酸(1~3个)的不同引物,然后PCR扩增,结果只有那些两端序列与选择性核苷酸配对的酶切片段被扩增。最后将被扩增的片段在高分辨率的测序凝胶上电泳
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