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动物固体组织蛋白提取Protocol
前夜将磁珠及匀浆管洗净置入75%乙醇中浸泡。早晨取出磁珠和匀浆管,自然晾干;也可放入烤箱中,速度较快。
裂解液配制:RIPA:PMSF=100:1,现配现用。(1000ulRIPA+10ulPMSF)。置入4℃冰上。
3、抽蛋白(应冰上进行):
a、适量组织(最好放入液氮中反复研磨成粉状)加入裂解液中。一般10ml管体系中加入:7-8粒磁珠、100mg组织、1mlRIPA+10ulPMSF、1tabletCocktail。
b、匀浆。
手工匀浆:将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中,再将剩余的1/3匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块,一起倒入匀浆管中进行匀浆,左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中,右手将捣杆垂直插入套管中,上下转动研磨数十次(6~8分钟),充分研碎,使组织匀浆化。
机器匀浆:用组织捣碎机10000~15000r/min上下研磨制成10%组织匀浆,也可用内切式组织匀浆机制备(匀浆时间10秒/次,间隙30秒,连续3~5次,在冰水中进行),皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。
超声粉碎:用超声粉碎机进行粉碎,可用Soniprep150型超声波发生器以振幅14微米超声处理30秒使细胞破碎,也可用国产超声波发生仪,用40安培,5秒/次,间隙10秒反复3~5次。
反复冻融:培养或者分离的细胞可以用以上的方法匀浆,也可以反复冻溶3次左右(即让细胞加适量的低渗液或者双蒸水放低温冰箱中结冰,溶解,再结冰,再溶解,反复3次左右),但有部分酶活力会受影响。
c、将组织匀浆转入1.5ml的EP管中(eppendorf管、离心管)。12000r/min4°C离心15min。
d、离心后EP管中液体分三层,提取中间无色液相,移入新的EP管中。可-80℃保存。
4、蛋白浓度测定。
a、配工作液:溶液A:溶液B=50:1(200ul:4ul)。
需测试复孔。标本X,则需A量=2*(X+1+1)*200;B=2*(X+1+1)*4。
LOSTWT
LOST
WT
c、复孔,取蛋白6ul加入0.6mlEP管,再加入54ulH2O,混匀。即10倍稀释。
d、取20-25ul10倍稀释蛋白样本加入96孔板平底板内,再加入200ulAB工作液,混匀振荡后,37℃incubate30min。
注:应现加蛋白样本,再加工作液。因为每次加蛋白后需换tip,再加入工作液即起反应,应缩短时间。
e、酶标仪检测562nm吸光度。Program
f、计算蛋白浓度。
根据标准曲线,如Y=1.2745X-0.1684其中Y:蛋白浓度;X:吸光度。
最终蛋白浓度为:10*Y(ug/ul、mg/ml)
g、蛋白样本放-80℃冻存。
大多数蛋白样品可通过比色测定法定量。在典型的蛋白测定中,化学试剂加入到蛋白样品溶液里产生颜色变化,这一变化可由分光光度计或酶标仪检测,并与已知浓度的蛋白标准曲线作比较。博士德为大家提供两种蛋白测定手段,每种都有其独特的优点。如果样品数量较多,可以同时使用两种测定用酶标仪自动检测。当你选择一种蛋白测定方法时需要考虑两个因素:缓冲液的化学组成和检测的蛋白量。
Commassie法(Bradford法):
原理:在酸性条件,蛋白质与考马斯染料G-250结合,颜色从棕色变为蓝色,在595nm处检测吸光值然后与标准曲线对比,即可计算出待测蛋白的浓度。
BCA法:
原理:在碱性条件下,蛋白将Cu++还原为Cu+,Cu+与BCA试剂形成紫色络合物,测定其在562nm处的吸收值,并与标准曲线对比,即可计算待测蛋白的浓度。
现对这两种方法进行比较:
一、实验材料:
细胞总蛋白提取试剂盒(AR0103)
M231
BCA蛋白定量试剂盒(AR0146)
Commassie改良增强型蛋白质定量试剂盒(AR0145)
二、操作步骤:
Commassie法:
1.将BSA冻干标准品(10mg/支)用生理盐水或PBS稀释成2000ug/ml,1000ug/ml,500ug/ml,250ug/ml,125ug/ml,62.5ug/ml,31.25ug/ml,15.625ug/ml八个浓度的蛋白标准溶液。
2.M231用细胞总蛋白提取试剂提取总蛋白。
3.各取20ul蛋白标准品和待测M231样品至相应标记的微孔板中。
4.滴加200ul考马斯增强型试剂(溶液A)至每孔混匀并充分震荡30S
5.停止震荡,在室温孵育样品10min
6.在酶标仪中测量595nm时的吸光值。
7.绘制标准曲线,再用标准曲线判断出样品的蛋白浓度。
BCA法:
1.按50体积BCA试剂A加入1倍体积BCA试剂B配置适量BCA工作液,充分混匀。
2.将BSA冻干标准品(10mg/支)用生理盐水或
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