质粒酶切鉴定.ppt

分子亚克隆PCR酶切连接转化挑克隆提质粒酶切鉴定测序实验一质粒的制备质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具有重要作用。质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。质粒的提取方法很多，大多包括3个主要步骤：细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒DNA的分离和纯化。实验原理在pH12.0~12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。电泳检测：质粒电泳一般有三条带，分别为质粒的超螺旋、开环、线型三种构型吸光值检测：采用分光光度计检测260nm、280nm波长吸光值，若吸光值260nm/280nm的比值介于1.7－1.9之间，说明质粒质量较好，1.8为最佳，低于1.8说明有蛋白质污染，大于1.8说明有RNA污染。实验步骤：取含有质粒的大肠杆菌菌液于LB培养基上37℃过夜培养；用无菌牙签挑取单菌落，接种于含有Amp抗生素的LB培养基中，37℃摇床~250r/min过夜培养；吸取1.5ml菌液，12000g离心2分钟，收集菌体，倒掉菌液；吸取1.5ml菌液，再次收集菌体，尽量将菌液倒干净；加入300ul溶液I振荡打匀，重新悬浮细胞，震荡混匀（注意：应彻底打匀沉淀或碎块）；加入300ul溶液II，轻柔颠倒混匀，放置至清亮，一般不超过5分钟；加入300ul溶液III颠倒混匀，放置于冰上10分钟，使杂质充分沉淀；12000g离心10分钟；吸取800ul上清液（注意：不要吸取到飘浮的杂质）至另一Eppendorf管中，加入2/3体积的异丙醇，室温下放置5分钟；12000g常温离心15分钟；倒尽上清，加75％乙醇浸洗除盐（放置片刻或离心3分钟后倒去上清）；室温放置或超净台上风干DNA；加40?l灭菌超纯水或TE溶解；质粒质量检测，于-20℃保存。实验二DNA的琼脂糖凝胶电泳

带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多，应用非常广泛，它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用方法。实验原理在pH值为8.0~8.3时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。凝胶上所加电压不应超过5V/cm。实验步骤用胶带将洗净、干燥的制胶板的两端封好，水平放置在工作台上；调整好梳子的高度；称取0.24g琼脂糖于30ml0.5×TBE中，在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解，冷却至45-50oC时倒入制胶板中；凝胶凝固后，小心拔去梳子，撕下胶带；将电泳样品与溴酚蓝混合后将样品依次点入加样孔中；vector5μl+ddH2O4μl+10×溴酚蓝1μl共10μl于0.5mltube中混合后点样；将制胶板放入电泳槽中，加入电泳液，打开电泳仪，使核酸样品向正极泳动；电泳完成后切断电源，取出凝胶，放入0.5μg/ml的溴化乙锭（EB）溶液中染色10－15min，清水漂洗后置于紫外透射仪上观察电泳结果，并照相记录。实验三外源DNA片段在质粒载体中的克隆DNA重组技术包括载体及外源DNA片段的酶切消化、目的片段的获得及纯化、目的片段与克隆载体的体外连接、重组子的筛选和鉴定等内容。实验原理限制性内切酶可识别特定位点并切割DNA产生粘性末端或平端的外源片段，经DNA的纯化处理后用于连接反应；选择克隆载体多克隆位点上相应的限制性内切酶切割，并进行回收；在连接酶的作用下将外源片段连接到载体上，实现外源片段的克隆。克隆中用到的几种工具酶：（1）限制性内切酶限制性内切酶的一个活性单位（1U）：指在15ul反应体系中，37℃下，经过1小时的反应将1ugDNA完全切割所需要的酶量。限制性内切酶的star活性：限制酶在某些条件下使用时对DNA切割的位点特异性可能降低，即可以切割与原来识别的特定DNA序列不同的碱基序列，这种现象叫限制酶的star活性。它的出现与限制酶、底物DNA以及反应条件有关。